STAT3信號通路調(diào)控新生小鼠耳蝸毛細胞轉分化及Pmca2突變小鼠內(nèi)耳基因治療.pdf

1、本文分兩個部分進行探討：
　　第一部分：STAT3信號通路調(diào)控耳蝸毛細胞轉分化
　　目的：由于衰老、噪音和耳毒性藥物導致的毛細胞不可逆損傷和缺失凋亡是致人類聽力下降和平衡功能障礙的主要因素，聽力下降已經(jīng)是美國老年群體發(fā)病率第三高疾病。哺乳動物毛細胞的不可再生性是耳聾治療困境之一，通過刺激毛細胞再生來重建聽覺器官結構和功能是治療聽力損失的理想選擇。小鼠耳蝸基底膜體外培養(yǎng)模型是研究毛細胞再生簡單有效的手段。在促進毛細胞再生藥物篩

2、選過程中發(fā)現(xiàn)一種STAT3信號通路激活劑SD19可以促進P0/1階段CD1小鼠耳蝸毛細胞數(shù)目增多，進一步研究表明其機制為促進支持細胞轉分化。本研究在小鼠耳蝸基底膜體外培養(yǎng)體系應用此種化合物，以期探索STAT3通路在哺乳動物耳蝸毛細胞再生中作用及機制，從而為哺乳動物聽覺上皮毛細胞再生提供研究新方向，為藥物促進毛細胞再生提供理論依據(jù)。
　　方法：1)探索新生CD1小鼠耳蝸基底膜和螺旋韌帶體外共培養(yǎng)的模型，摸索不破壞毛細胞和支持細胞存活

3、的培養(yǎng)條件，進一步探索不同濃度STAT3通路激活劑SD19對毛細胞影響；
　　2)在不同年齡段新生CD1小鼠耳蝸基底膜和螺旋韌帶體外共培養(yǎng)的模型中使用STAT3通路激活劑SD19，探索STAT3通路在不同發(fā)育階段耳蝸中作用；
　　3)研究在正常CD1小鼠和新霉素損傷毛細胞不同情況下，STAT3通路激活劑SD19的作用;
　　4)在新生CD1小鼠耳蝸基底膜培養(yǎng)模型中聯(lián)合使用STAT3通路抑制劑，進一步確定STAT3通路作

4、用；
　　5)在新生CD1小鼠耳蝸基底膜培養(yǎng)模型中利用FM1-43標記原始耳蝸毛細胞，再使用STAT3通路激活劑SD19，探究新生毛細胞的來源；
　　6)使用培養(yǎng)的Sox-2creER+/_/ tdTomato轉基因鼠來研究新生毛細胞來源，培養(yǎng)基中加入Tomaxifen激活Cre從而所有的支持細胞表達Tomato，觀察新生毛細胞是否是支持細胞來源；
　　7)研究CD1小鼠耳蝸基底膜培養(yǎng)模型中使用STAT3通路激活劑SD

5、19之后相關基因表達的變化。
　　結果：1)4μM和8μM的STAT3通路激活劑SD19可以明顯增加新生P0/1階段CD1小鼠頂圈和中圈耳蝸毛細胞數(shù)目，所有濃度對P3、P5階段耳蝸毛細胞沒有明顯效果。新霉素損傷和正常處理均未見有Edu陽性細胞，毛細胞數(shù)目沒有明顯改變。聯(lián)合使用STAT3抑制劑則未見毛細胞增多。在應用STAT3通路激活劑SD19之后可以發(fā)現(xiàn)更多FM1-43陰性而Myo7a陽性細胞，進一步證明新生毛細胞產(chǎn)生。Linea

6、ge tracing結果表明新生毛細胞是支持細胞起源。
　　2)P0階段CD1小鼠耳蝸基底膜培養(yǎng)模型中加入8μM的STAT3通路激活劑SD19可以上調(diào)Stat3和Jak1基因來激活STAT3通路，同時上調(diào)Hes1基因、Math1基因、抑制Notch基因，提示增多的毛細胞來自于轉分化。
　　結論：通過本研究，證實了STAT3通路在小鼠新生耳蝸毛細胞轉分化過程中發(fā)揮作用，激活STAT3通路可以促進支持細胞向毛細胞轉分化。STAT

7、3通路對Notch通路有一定的調(diào)控作用。
　　第二部分：Pmca2突變小鼠的內(nèi)耳基因治療
　　目的：NIDCD數(shù)據(jù)表明17％美國成人患有聽力下降，其中由上百種基因突變引起的遺傳性耳聾目前沒有治療方法。內(nèi)耳的外源性基因的導入和基因治療，為耳聾的治療帶來了新的手段。腺病毒及腺相關病毒是內(nèi)耳基因治療常見的載體，但不同亞型可以轉染不同類型細胞。Pmca2是外毛細胞纖毛上鈣通道ATP酶，其功能缺陷則導致鈣離子在胞內(nèi)蓄積，最終造成聽力喪

8、失。無論是純合還是雜合型成年Pmca2基因突變小鼠均表現(xiàn)為重度耳聾。首先篩選能夠特異性轉染毛細胞的病毒，然后體外克隆Pmca2基因，將外源性Pmca2基因導入新生Pmca2突變鼠內(nèi)耳，通過干預遺傳性耳聾動物模型毛細胞基因來表達探索從基因水平治療遺傳性耳聾。
　　方法：1)使用納升2010顯微操作注射系統(tǒng)，向小鼠中圈附近中階注射攜帶增強型綠色焚光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein EGFP)的

9、6種不同血清型的AAV(AAV2.2-CMV-eGFP，AAV2.2-CASI-eGFP，AAV2.8-CMV-eGFP，AAV2.8-CASI-eGFP，AAV2.9-CMV-eGFP，AAV2.9-CASI-eGFP)和1種攜帶綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein EGFP)腺病毒（Ad5-CMV-GFP)，在內(nèi)耳注射3d，5d，lw，2w，lm后取雙側耳蝸標本做基底膜鋪片，觀察EGFP或GFP表達情況；

10、
　　2)將能夠轉染毛細胞的AAV2.8-CMV-eGFP，AAV2.9-CMV-eGFP顯微注射入新生野生型小鼠（P0/P1)右側耳蝸中圈附近中階，6w后使用ABR和DP0AE評價雙側聽力；
　　3)克隆Pmca2質(zhì)粒，并分別包裝進AAV2.8-CMV和Ad5-CMV-GFP病毒；
　　4)用Lipofectamine2000轉載Pmca2質(zhì)粒轉染Cos7細胞系，AAV2.8-CMV-Pmca2-HA和Ad5-CMV

11、-Pmca2-GFP轉染Cos7細胞系，通過免疫組化和Western Blot評價病毒的功效；
　　5)在新生的Pmca2突變小鼠（P0-P1)右側中階注射AAV2.8-CMV-Pmca2-HA或Ad5-CMV-Pmca2-GFP0.3和0.6^L，在注射后的lw、6w分別取雙側耳蝸標本做基底膜鋪片，并在6w使用ABR和DPOAE評價雙側聽力。
　　結果：1)新生鼠在中階注射后lw后，AAV2.8-CMV-eGFP和AAV2

12、.9-CMV-eGFP以及Ad5-CMV-GFP組可見支持細胞、毛細胞、螺旋韌帶、螺旋神經(jīng)節(jié)、前庭感覺細胞表達GFP，至少持續(xù)表達2m以上；
　　2)野生型新生鼠中階注射AAV2.8-CMV-eGFP和AAV2.9-CMV-eGFP，6w后，相比對側耳，注射耳聽力下降0-15dB;
　　3)Pmca2質(zhì)?？梢酝ㄟ^與Lipofectamine2000形成脂質(zhì)體轉染Cos7細胞系并產(chǎn)生Pmca2蛋白，AAV2.8-CMV-Pmc

13、a2-HA不能轉染Cos7細胞系，Ad5-CMV-Pmca2-GFP轉染并表達Pmca2基因；
　　4)新生Pmca2基因突變小鼠（P0-P1)中階注射入AAV2.8-CMV-Pmca2-HA不能檢測到HA標記；
　　5)Ad5-CMV-Pmca2-GFP之后，lw后基底膜鋪片免疫組化結果表明Pmca2在毛細胞表達，但6w后聽力無明顯改善，免疫組化結果表明部分少數(shù)細胞表達Pmca2。
　　結論：1)采用經(jīng)中階入路顯微注

14、射5型腺病毒攜帶目的基因導入新生鼠能夠將目的基因成功轉染至耳蝸組織并表達；
　　2)采用經(jīng)中階顯微注射AAV2.8-CMV-eGFP和AAV2.9_CMV-eGFP攜帶目的基因導入新生鼠能夠將目的基因成功轉染至耳蝸組織并表達，并且新生鼠只有輕微的聽力下降；
　　3)腺相關病毒對耳蝸毛細胞沒有毒性，并最少可以有效轉染兩個月，但其包裝能力有限，腺病毒對毛細胞有一定毒性；
　　4)腺相關病毒的包裝能力有限，無法完全包裝Pmc