紫杉醇發(fā)揮抗癌效應(yīng)的濃度依賴機(jī)制及其與Bub1的相關(guān)性研究.pdf

1、本研究分為二部分：第一部分:紫杉醇對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用及其濃度依賴機(jī)制探討
　　 目的: 探討不同濃度紫杉醇對(duì)卵巢癌細(xì)胞發(fā)揮抗癌效應(yīng)的機(jī)制以及紫杉醇誘導(dǎo)G2/M期阻滯與紡錘體檢測(cè)點(diǎn)蛋白Bub1的相關(guān)性。
　　 方法: 以50、10、1、0.1、0.01uM紫杉醇作用于人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780，以未加藥細(xì)胞作為對(duì)照組，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度，不同時(shí)間紫杉醇作用下A2780細(xì)胞的周期分布變化情況。以50uM、1uM、0.0

2、1uM紫杉醇A2780細(xì)胞，作用時(shí)間依次為12、24、24小時(shí)，未加藥細(xì)胞作為對(duì)照組，流式檢測(cè)G2/M期阻滯情況，RT-PCR檢測(cè)Bub1mRNA的表達(dá)差異；采用胸苷對(duì)A2780細(xì)胞進(jìn)行同步化處理后，流式分析0.01uM紫杉醇對(duì)細(xì)胞周期的影響；Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)分析50uM紫杉醇對(duì)細(xì)胞壞死的影響。
　　 結(jié)果:
　　 (1)當(dāng)紫杉醇濃度為10uM，1uM，0.1uM時(shí)，G2/M期細(xì)胞比例明顯高于50u

3、M（P＜0.001），0.01uM組（P＜0.001）。且1uM組阻滯可持續(xù)至72小時(shí)，50uM組36小時(shí)后即觀察不到G2/M期阻滯，5nM組與未處理組相比始終未檢測(cè)到G2/M期阻滯。
　　 (2)1uM處理組G2/M期細(xì)胞比例和Bub1mRNA的表達(dá)均明顯高于另外兩個(gè)濃度組和未處理細(xì)胞。
　　 (3)A2780細(xì)胞經(jīng)同步化處理后給予0.01uM紫杉醇，經(jīng)過(guò)一個(gè)細(xì)胞倍增時(shí)間未觀察到G0/G1期阻滯。
　　 (4)

4、50uM處理組壞死細(xì)胞的比例明顯高于1uM，0.01uM組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。
　　 結(jié)論:不同濃度紫杉醇發(fā)揮抗癌效應(yīng)的機(jī)制不同，紫杉醇誘導(dǎo)G2/M期阻滯與紡錘體檢測(cè)點(diǎn)Bub1的表達(dá)呈正相關(guān)。
　　 第二部分:紫杉醇發(fā)揮抗癌效應(yīng)依賴于紡錘體檢測(cè)點(diǎn)蛋白Bub1
　　 目的: 探討紡錘體檢測(cè)點(diǎn)蛋白Bub1在紫杉醇誘導(dǎo)G2/M期阻滯和發(fā)揮抗癌效應(yīng)中的作用。
　　 方法:
　　 (1)以

5、不同濃度紫杉醇分別作用于A2780和A2780/TS細(xì)胞，作用時(shí)間為24小時(shí)，采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期；通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，以1uM紫杉醇分別作用于A2780和A2780/TS細(xì)胞，作用時(shí)間為24，36，48小時(shí)，通過(guò)流式檢測(cè)凋亡情況。
　　 (2)采用胸苷和紫杉醇分別將A2780和A2780/TS細(xì)胞阻滯在G1/S早期和G2/M期，A2780和A2780/TS作為配對(duì)細(xì)胞，采用western－blot比較兩株細(xì)胞分

6、別在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，G1/S期和G2/M期Bub1蛋白的表達(dá)差異。
　　 (3)構(gòu)建Bub1的 shRNA表達(dá)載體（Bub1-shRNA），采用RNA干擾技術(shù)封閉A2780細(xì)胞中Bub1的表達(dá)，運(yùn)用RT－PCR和western－blot檢測(cè)Bub1的封閉情況。
　　 (4)Bub1-shRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后給予紫杉醇，運(yùn)用PI單染、流式分析細(xì)胞周期和中、晚期凋亡情況；Annexin V單染、流式分析早期凋亡情

7、況；采用Hoechst 33342染色法檢測(cè)有絲分裂指數(shù)。
　　 結(jié)果:
　　 (1)A2780與A2780/TS細(xì)胞均在0.1-10uM的濃度范圍內(nèi)有高比例的G2/M期細(xì)胞含量，某些濃度下紫杉醇對(duì)前者誘導(dǎo)G2/M期阻滯的作用要強(qiáng)于后者（P1uM=0.045，P10uM=0.036）。MTT法檢測(cè)和流式分析均證實(shí)A2780細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性明顯高于A2780/TS細(xì)胞，（P0.01uM、P0.1uM、P1uM＜0.00

8、1，P10uM=0.021；P24h、P36h、P48h＜0.001）。
　　 (2)A2780和A2780/TS細(xì)胞經(jīng)1uM紫杉醇處理后，G2/M期細(xì)胞的比例和Bub1的表達(dá)均明顯高于對(duì)照細(xì)胞。
　　 (3)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，G1/S期和G2/M期，A2780細(xì)胞Bub1蛋白的表達(dá)均高于A2780/TS細(xì)胞。
　　 (4)RT－PCR，western－blot均顯示轉(zhuǎn)染Bub1-shRNA后，A2780細(xì)胞中Bub

9、1蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)。
　　 (5)封閉A2780細(xì)胞Bub1的表達(dá)后，有絲分裂指數(shù)降低（p=0.022）；G2/M期細(xì)胞比例減少，G0-G1期和S期細(xì)胞比例升高（PG2/M=0.018，PG0-G1=0.041，PS=0.024）；紫杉醇誘導(dǎo)中、晚期凋亡的效應(yīng)明顯減弱（p=0.027），紫杉醇誘導(dǎo)早期凋亡的效應(yīng)并不受影響（p=0.236）；紫杉醇對(duì)A2780細(xì)胞的增殖抑制率明顯減弱（P0.1uM=0.037，P1uM=0.04