13776.nadh氧化酶密碼子優(yōu)化及其與甘油脫氫酶的基因融合

1、廈門大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下，獨(dú)立完成的研究成果。本人在論文寫作中參考其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表的研究成果，均在文中以適當(dāng)方式明確標(biāo)明，并符合法律規(guī)范和《廈門大學(xué)研究生學(xué)術(shù)活動(dòng)規(guī)范(試行)》。另外，該學(xué)位論文為()課題(組)的研究成果，獲得()課題(組)經(jīng)費(fèi)或?qū)嶒?yàn)室的資助，在()實(shí)驗(yàn)室完成。(請?jiān)谝陨侠ㄌ杻?nèi)填寫課題或課題組負(fù)責(zé)人或?qū)嶒?yàn)室名稱，未有此項(xiàng)聲明內(nèi)容的，可以不作特別聲明。)聲明人(簽名)：閡碣D∥弓

2、年多月9日摘要摘要NADH氧化酶(NOX)是一類催化NADH氧化為NAD，并消耗02的氧化還原酶。由于其在維持生物體內(nèi)NAD小ADH平衡、輔因子再生和抵抗氧毒害等方面發(fā)揮著重要作用，因此受到越來越廣泛關(guān)注。本研究克隆出短乳桿菌LactobacillusbrevisATCC367基因組中的NADH氧化酶基因lOX，實(shí)現(xiàn)了在EcoliBL21(DE3)hb的有效表達(dá)。在克隆表達(dá)的基礎(chǔ)之上，為了進(jìn)一步提高NADH氧化酶活性，本文還對nox進(jìn)行

3、密碼子優(yōu)化，并建立了密碼子優(yōu)化平臺。最后，構(gòu)建了NADH氧化酶與甘油脫氫酶(GDH)的融合蛋白(GDHNOX)，進(jìn)一步探討此酶在生物催化中的應(yīng)用。本研究主要包括的內(nèi)容和結(jié)果如下：一、在EcoliBL21(DE3)實(shí)現(xiàn)了NADH氧化酶的異源表達(dá)。以LactobacillusbrevisATCC367中相應(yīng)基因?yàn)槟０澹ㄟ^PCR擴(kuò)增目的基因rlOX，構(gòu)建重組表達(dá)菌株BL21pET32anox。NOX酶活性最適pH為70，最適溫度為37℃。測

4、得細(xì)胞抽提液中NOX比活性為289U／mg，動(dòng)力學(xué)參數(shù)‰和％烈分別為6261tM、599pM／min。二、對NOX基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，提高蛋白表達(dá)量。為了提高NOX在EcoliBL21(DE3)中的蛋白表達(dá)量，在不改變氨基酸序列的情況下，本文從兩個(gè)方面對nox進(jìn)行優(yōu)化。一方面，利用定點(diǎn)突變技術(shù)，提高基因起始密碼子下游2—6位密碼子AT含量，從而提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)量，這可能是由于更易形成結(jié)構(gòu)松散的mRNA，提高翻譯起始復(fù)合物形成效率。另一

5、方面，從全局出發(fā)對整個(gè)基因序列進(jìn)行重新排列，以使得密碼子使用頻率與EcoliBL21(DE3)基因組密碼子使用頻率保持一致，從而提高目的蛋白的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用定點(diǎn)突變技術(shù)局部優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)，細(xì)胞抽提液中NOX比活性提高至599U／mg，而全序列優(yōu)化后，細(xì)胞抽提液中NOX比活性提高至733U／mg。利用制備型液相色譜對細(xì)胞抽提液進(jìn)行純化，純化后NOX比活性可達(dá)2138U／mg。三、構(gòu)建了NADH氧化酶與甘油脫氫酶的融合蛋白(GDH