轉Mad1基因球孢白僵菌工程菌株的構建及鑒定.pdf

1、在全球關注綠色無公害農業(yè)的大前提下，微生物農藥得到了廣泛的關注和長足的發(fā)展，雖然存在著寄主范圍廣、致病力強、對人畜無害等優(yōu)點，不過缺點也是顯而易見的，如致病潛伏期長，殺蟲時效性較差、對環(huán)境條件要求高等缺點，使得微生物殺蟲劑的推廣仍然受到限制。因此利用基因工程等技術手段改造真菌，獲得具有更高殺蟲力并適應市場需求的微生物殺蟲劑將具有重要的應用價值。球孢白僵菌（Beauveria bassiana）作為重要的昆蟲病原真菌在害蟲的生物防治中發(fā)揮

2、著重要作用。目前許多球孢白僵菌的基因工程研究主要集中在毒力直接相關基因的轉化和表達，如蛋白酶基因、幾丁質酶基因、毒素基因等，存在著一定的生物安全性問題，本研究所導入的外源基因來自于金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae），并且該基因非直接毒素基因，而是通過空氣表達增加蟲生真菌黏著性，促進孢子對昆蟲體壁的吸附，從而增加毒力，縮短作用時間，對未來白僵菌基因工程菌株的選育提供了材料。
　　本研究克隆了來源于生防真菌綠

3、僵菌的黏著蛋白基因Mad1，構建到遺傳轉化載體上。采用溶壁酶和β-巰基乙醇裂解白僵菌細胞壁，得到的原生質體濃度達到108sp/mL，再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)經計算其再生率為15％。使用抗殺菌劑萎銹靈基因Carboxin做為抗性篩選標記，經抗性濃度篩選確定其抗性終濃度為180ng/mL。利用PEG介導的原生質體遺傳轉化體系導入受體球孢白僵菌菌株，獲得轉化子，經過繼代培養(yǎng)及分子檢測，獲得遺傳穩(wěn)定的基因工程菌株。
　　利用蝗蟲內翅及洋蔥表皮進行

4、吸附試驗進行了工程菌株的生物學功能鑒定。研究結果表明，野生型和工程菌的分生孢子對于洋蔥表皮的吸附量并無明顯差異，而工程菌的分生孢子對蝗蟲翅膀的吸附則顯著高于野生型，表明Mad1基因的導入能夠增加球孢白僵菌對昆蟲組織的吸附，而對植物表皮組織不存在吸附能力；對亞洲玉米螟幼蟲室內毒力測定結果表明轉化后的工程菌株 LT50值（3.278±0.346天）要比野生型（4.972±0.147天）縮短1天。殺蟲率方面轉化后的工程菌株殺蟲校正死亡率在第七