鴿源禽毛滴蟲G3蛋白克隆、原核表達(dá)及免疫原性鑒定.pdf

1、鴿源禽毛滴蟲又稱鴿毛滴蟲，屬鞭毛蟲綱、毛滴蟲科、毛滴蟲屬，其嗜好寄生部位是鴿消化道前段，引起各種消化道癥狀，導(dǎo)致鴿毛滴蟲病，本病沒有季節(jié)性，宿主對(duì)本病的敏感性沒有品種和日齡的差別，其中幼鴿對(duì)本病最為敏感，成年鴿抵抗力強(qiáng)，常呈無癥狀的隱性感染。蟲體寄生于粘膜上皮細(xì)胞間隙處，發(fā)病時(shí)表現(xiàn)為一層壞死性潰瘍覆蓋于口腔、食道、嗉囊、胃部粘膜之上，癥狀嚴(yán)重時(shí)粘膜外覆蓋黃色粗糙的干酪樣滲出物，導(dǎo)致患鴿呼吸和采食困難，口腔分泌物增多，眼觀癥狀比較直觀的是

2、胸部羽毛臟亂，癥狀進(jìn)一步發(fā)展會(huì)造成宿主死亡。目前治療本病常采用化學(xué)藥物，藥物對(duì)動(dòng)物容易產(chǎn)生副作用，且抗藥蟲株很容易被藥物的選擇壓力下誘導(dǎo)產(chǎn)生。有必要深入了解疫苗相關(guān)蛋白分子，開發(fā)安全有效的防治方法。G3蛋白有多個(gè)開放閱讀框，具有良好的免疫原性，本研究將新型蛋白進(jìn)行克隆表達(dá)，鑒定其免疫原性，評(píng)估其開發(fā)新型疫苗的可能性，為防控鴿毛滴蟲病提供新途徑。
　　主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下：
　　1.鴿源禽毛滴蟲G3（TgG3）蛋白的克隆及測(cè)

3、序
　　根據(jù)已上傳的陰道毛滴蟲G3（TvG3）蛋白部分基因序列ORF設(shè)計(jì)引物，提取鴿源禽毛滴蟲總RNA，反轉(zhuǎn)錄，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得TgG3蛋白基因序列。經(jīng)TA克隆至pJET1.2克隆質(zhì)粒里，經(jīng)生工測(cè)序，TgG3蛋白的ORF包含堿基序列1623bp，編碼540個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)理論分子量為63.7千道爾頓。
　　2.鴿源禽毛滴蟲G3（TgG3）蛋白的序列及生物信息學(xué)分析
　　比對(duì)鴿源禽毛滴蟲G3（TgG3）蛋白與陰道毛滴蟲G

4、3（TvG3）蛋白的堿基序列，兩者堿基同源性為78％，從5’端到3’端差異均勻分布，每隔幾個(gè)堿基就有差異出現(xiàn)，未檢索到TgG3堿基序列與其他蛋白有很大同源性。經(jīng)氨基酸序列比對(duì)，鴿源禽毛滴蟲G3（TgG3）蛋白與陰道毛滴蟲G3（TvG3）蛋白氨基酸同源性達(dá)98%，氨基酸序列有9處不同。該蛋白與胎兒三毛滴蟲TRFO_13881蛋白氨基酸同源性達(dá)83%。使用生物信息學(xué)軟件對(duì)鴿源禽毛滴蟲G3（TgG3）蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，顯示TgG3蛋

5、白無前導(dǎo)肽和信號(hào)肽、有親水性、為堿性氨基酸、無GPI，有SMC結(jié)構(gòu)域。
　　3.鴿源禽毛滴蟲G3重組蛋白多克隆抗體的制備
　　采用同源重組法，用CloneEZ PCR克隆試劑盒構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-G3,將重組陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli transetta中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，將菌體超聲破碎，取包涵體用尿素溶解、經(jīng)Ni柱純化。SDS-PAGE電泳顯示，原核表達(dá)的重組蛋白大小約為63.7KDa，與軟件預(yù)計(jì)的分子量大小相符。

6、將純化后的原核表達(dá)鴿源禽毛滴蟲G3蛋白加佐劑免疫小鼠，制備多克隆抗體高免血清，用間接ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)。采用Westerm-blot鑒定分析G3重組蛋白的抗原性，制備的小鼠多抗能夠識(shí)別pET28a-G3原核表達(dá)的重組蛋白，原核表達(dá)的重組蛋白具有良好的抗原性。
　　4.多抗與蟲體天然蛋白反應(yīng)性檢測(cè)
　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的蟲體裂解經(jīng)蛋白質(zhì)電泳，用抗G3蛋白小鼠多抗進(jìn)行Western-blot，結(jié)果顯示，鴿源禽毛滴蟲蟲體中有