小麥穎果與根部中Cathepsin B-like蛋白功能的初步研究.pdf

1、細胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)指在生物的生長發(fā)育過程中，由自身基因編碼的、主動和有序的細胞死亡過程，是生物體自身新陳代謝和發(fā)育的正常生理反應。本實驗室前期研究證實，小麥韌皮部篩分子(sieve elements，SEs)的發(fā)育經歷了一個程序性細胞半死亡(programmed cell semi-death)過程;同時，包括植物根冠、小麥穎果內糊粉層等多處部位在內的組織細胞也均被證明發(fā)生了PCD。這些

2、細胞的PCD過程均發(fā)生在相應組織的發(fā)育階段，與發(fā)育過程的推進密切相關，那么這些不同組織的PCD過程之間是否存在著相關的調控機理和相似的作用因子呢？這是本研究試圖解決的問題。
　　 本研究以小麥(Triticum aestivum L.)品種華麥八號為實驗材料，利用熒光顯微鏡、免疫組織化學技術、活性原位熒光染色、分子生物學技術、免疫電鏡技術、金屬自顯影以及TSQ熒光探針檢測等方法，研究在小麥根尖與穎果發(fā)育過程中發(fā)生的PCD的調控過

3、程以及cathepsin B-like蛋白酶在這些過程中的作用。主要結果如下:
　　 1、熒光顯微鏡觀察發(fā)現，隨著SEs的發(fā)育，細胞壁開始增厚，自發(fā)熒光的強度也相應發(fā)生變化，這為我們研究SEs中cathepsin B-like蛋白的變化提供了時間上的參考。
　　 2、免疫組織化學檢測表明，距根尖頂端112μm處的根冠組織中，外緣1-3層細胞的cathepsin B-like蛋白陽性反應強烈;在距根尖頂端約490-700μ

4、m處的組織中可以觀察到細胞內陽性信號逐漸減弱，其中皮層中部薄壁細胞內的信號相對于外皮層和中柱細胞內的陽性信號減弱速度較快;同時，隨著SEs與導管的發(fā)育，細胞內cathepsin B-like蛋白的陽性信號也逐漸消失。
　　 3、活性原位熒光染色技術顯示根尖中的cathepsin B-like蛋白可以降解cathepsin B的特異性底物，并在熒光顯微鏡下呈現紅色陽性信號。RT-PCR結果顯示在根尖組織中有兩種cathepsin

5、B-like蛋白的mRNA積累:AI16和一個被命名為2529的蛋白。
　　 4、免疫電鏡結果顯示cathepsin B-like蛋白分布在發(fā)生PCD的細胞的細胞質和細胞核中，液泡中有零星分布。自噬小體中沒有觀察到cathepsin B-like蛋白的存在。
　　 5、金屬自顯影結果顯示在根尖細胞的核仁中有Zn2+存在。隨著組織的發(fā)育，SEs與木質部導管細胞中的核仁和Zn2+逐漸消失。
　　 6、TSQ熒光探針標

6、記顯示，外源Zn2+主要在根尖組織的中柱中積累，在熒光顯微鏡下呈藍色熒光，熒光強度隨著距根尖頂端距離的增加而減弱。
　　 7、免疫組織化學染色結果顯示，隨著培養(yǎng)時加入ZnCl2濃度的提高，組織中表達cathepsin B-like蛋白的細胞數量有所下降，同時表達強度也有所降低。
　　 8.免疫組織化學結果顯示，在小麥花后1天(1 DAF)到9天的穎果內，cathepsinB-like蛋白的分布位置主要集中在灌漿池兩側維管

7、束以及內果皮細胞中;花后12至24天的小麥穎果中，灌漿池兩側維管束細胞中的cathepsin B-like蛋白開始消失，同時穎果糊粉層內的cathepsin B-like蛋白含量開始逐漸增加，而存在于穎果背部內果皮細胞中的cathepsin B-like蛋白則出現含量下降，在細胞邊緣聚集等現象。
　　 以上結果說明在小麥發(fā)育過程的一些PCD過程中有共同的作用因子cathepsinB-like蛋白的參與;Cathepsin B-l