黃萎病菌誘導下海島棉cDNA文庫構建和抗病相關基因克隆.pdf

1、黃萎病(Verticillium wilt)是影響世界棉花生產的主要病害之一。育種實踐證明，培育抗病品種是控制棉花黃萎病的經濟有效途徑。研究證明海島棉Pima90-53對黃萎病具有高度抗性;對其抗黃萎病相關基因進行克隆研究不僅有利于闡明品種抗病機制，而且對棉花抗黃萎病的分子育種具有重要價值。本研究以海島棉Pima90-53為材料，構建其在黃萎病菌誘導下的根系cDNA文庫，并依據文庫克隆棉花抗黃萎病相關基因。主要結果如下:
　　

2、1.構建了黃萎病菌誘導下的海島棉Pima90-53根系的全長cDNA文庫
　　 采用SMART技術成功構建了黃萎病菌誘導下的Pima90-53根系全長cDNA文庫，該文庫基礎庫容量為1.28×106 PFU，重組率94％，擴增后文庫滴度大于1010 PFU·mL-1，插入片段平均長度1.1kb。經隨機測序共獲得45條cDNA序列，利用Blastx程序進行同源分析，4個contigs與假定抗病相關基因同源性較高;3個contigs

3、沒有注釋，可能為新基因。
　　 2.利用文庫篩選和RACE技術相結合，克隆了一個新的GbWRKY1基因
　　 利用構建的cDNA文庫，結合RACE技術，獲得了一個新WRKY基因（GbWRKY1）(GenBank No.JF831361)。Gb WRKY1基因cDNA全長1971bp，包括5'端非編碼區(qū)271bp，3'端非編碼區(qū)230bp，含有1個可能的polyA加尾信號:AATAAT;基因開放閱讀框為1470bp，編碼一

4、個由489個氨基酸構成的多肽。
　　 生物信息學分析發(fā)現GbWRKY1包括2高度保守的WRKY基本結構域和鋅指結構，屬于WRKY家族第Ⅰ類，與VvWRKY2、AtWRKY4和AtWRKY3蛋白的同源性分別為62％、61％和59％; GbWRKY1屬可溶性蛋白，無信號肽和跨膜結構域，包含N-糖基化位點、蛋白激酶C磷酸化位點、N端肉豆蔻?；稽c、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、依賴cAMP和cGMP蛋白激酶磷酸化位點等。
　　 Gb

5、 WRKY1基因含有3個內含子，具有有保守的GT-AG剪切位點，分別為599 bp、81 bp、325 bp?？寺〉玫紾bWRKY1的1762bp啟動子，包含植物病原誘導性啟動子調控元件(RAV1AAT、Box-W1、ARE、W-box、CGTCA-motif、ERE、TGACG-motif)與非生物脅迫應答元件(HSE、 TC-rich repeats、WRKY71OS、WBOXNTERF3、MYCATERD1)。
　　 構建

6、了基因融合表達載體pCamE-GbWRKY1-GFP，基因槍轉化洋蔥內表皮細胞，結果顯示轉化pCamE-GbWRKY1-GFP表皮細胞的細胞核出現綠色熒光，GbWRKY1蛋白定位于細胞核。
　　 3.Northern雜交分析了GbWRKY1在黃萎病菌接種后的表達模式，揭示了基因與棉花抗黃萎病的聯系;實時定量PCR分析了GbWRKY1在不同激素處理下的表達模式，為解析基因作用機制提供了依據;構建了Gb WRKY1超表達與RNAi載

7、體，獲得了轉基因T3擬南芥
　　 Northern雜交分析Gb WRKY1表達模式發(fā)現，基因在Pima90-53的根、莖和葉組織均有表達;在受黃萎病菌、SA、MeJA和ACC的誘導后呈現不同的表達模式。在黃萎病菌誘導后，Gb WRKY1基因在接種后出現持續(xù)高表達，在8h出現表達高峰，并持續(xù)高表達至接菌后12h。SA誘導后，其表達量在12h降到最低，24h基本恢復正常水平;MeJA誘導后，Gb WRKY1表達量上升，在12h達到高