松江鱸(Trachidemus fasciatus)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的克隆、表達(dá)與功能分析.pdf

1、松江鱸（Trachidermus fasciatus）是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴食用魚(yú)類(lèi)。但是，隨著環(huán)境壓力的日益增大，水體污染及興建河道水利等影響和破壞了松江鱸棲息、繁殖和洄游路線(xiàn)，導(dǎo)致該物種的種群數(shù)量銳減，分布區(qū)也急劇縮小，現(xiàn)已被列入國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。目前恢復(fù)其自然種群的主要途徑和手段是建立保護(hù)區(qū)和人工養(yǎng)殖，然而，養(yǎng)殖過(guò)程中的病害問(wèn)題日益嚴(yán)重。因此，從松江鱸機(jī)體本身的免疫防御入手，篩選并克隆一些與免疫防御密切相關(guān)的基因，研究其免疫防御的機(jī)制，

2、探討如何提高機(jī)體的抗逆能力，對(duì)于松江鱸的保護(hù)和養(yǎng)殖有著重要的意義。
　　 基于松江鱸的保護(hù)地位和現(xiàn)在所面臨的問(wèn)題本研究選取了三種與松江鱸解毒和免疫相關(guān)的GSTs(GSTA、GSTO、MGST3)進(jìn)行研究。有害物質(zhì)進(jìn)入生物體內(nèi)的解毒過(guò)程大致可以分為三相，GSTs是Ⅱ相解毒酶中的重要一員，有害物質(zhì)經(jīng)Ⅰ相酶代謝活化產(chǎn)生極性增加的毒性代謝產(chǎn)物，GSTs催化其與GSH結(jié)合，使其轉(zhuǎn)化為更溶于水或低毒的代謝物，然后再經(jīng)Ⅲ相的一系列反應(yīng)后排出體

3、外。本文采用RACE（Rapid amplification of cDNA ends）技術(shù)克隆得到了三種基因的cDNA全長(zhǎng)，并分析了它們的分子結(jié)構(gòu)特征;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitativereal time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)了三個(gè)基因的組織分布及LPS和重金屬刺激后的表達(dá)模式變化;構(gòu)建其原核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的重組表達(dá)，并在獲得純化蛋白后，制備了多克隆抗體，并對(duì)蛋白活性進(jìn)行了檢測(cè)。主要結(jié)果如下:

4、>　　 GSTA序列全長(zhǎng)988 bp，包括672 bp編碼223個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框，5'端非編碼區(qū)104 bp和3'端非編碼區(qū)212bp。GSTA預(yù)測(cè)分子量為25.5 kD，理論等電點(diǎn)(pI)為6.76。氨基酸同源比對(duì)表明，松江鱸與其他已知魚(yú)類(lèi)的同源性為60.89％-87％，與鳥(niǎo)類(lèi)以及哺乳類(lèi)的同源性為50.66％-54.63％。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GSTA在各個(gè)組織均有表達(dá)。LPS和重金屬刺激后GSTA表達(dá)存在明顯上調(diào)。成功構(gòu)建

5、了GSTA的pET-30a(+)重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化Escherichia coli BL21(DE3)表達(dá)菌株，在37℃下，IPTG誘導(dǎo)4h后獲得比預(yù)期稍大的約26 kD左右重組蛋白，經(jīng)檢測(cè)目的蛋白以包涵體形式存在。由High-Affinity Ni-IDA Resin親和柱進(jìn)一步純化，對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行了GST酶活性檢測(cè)，測(cè)得其比活為9.649±0.092μmol/mg/min，不同pH和溫度處理后發(fā)現(xiàn)其在pH9.0時(shí)和25℃時(shí)活力最大

6、。隨著變性劑尿素或SDS濃度的增加，重組蛋白TfGSTA的活性逐漸降低。
　　 獲得GSTO的cDNA序列全長(zhǎng)1136 bp，開(kāi)放閱讀框720 bp，編碼239個(gè)氨基酸。氨基酸同源比對(duì)顯示，松江鱸與其他已知魚(yú)類(lèi)的同源性為70.71％-77.41％，與鳥(niǎo)類(lèi)及哺乳類(lèi)的同源性為55.79％-56.61％。qRT-PCR結(jié)果顯示，GSTO在各個(gè)組織均有表達(dá)，但是表達(dá)量高低具有組織特異性。LPS和重金屬刺激后，GSTO表達(dá)存在明顯上調(diào)，表

7、明GSTO可能參與到松江鱸機(jī)體對(duì)微生物和重金屬的免疫防御中。成功構(gòu)建了GSTO的pET-30a(+)重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化E coli BL21(DE3)表達(dá)菌株，在37℃下，IPTG誘導(dǎo)4h后，獲得高表達(dá)量的約33 kD的目的蛋白。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)目的蛋白以包涵體形式存在。而25℃過(guò)夜誘導(dǎo)后部分目的蛋白為可溶蛋白。重組表達(dá)的粗蛋白經(jīng)High-Affinity Ni-IDA Resin親和柱進(jìn)一步純化。對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行了GST酶活性檢測(cè)，測(cè)得其比

8、活為6.260±0.052μmol/mg/min，不同pH和溫度處理后發(fā)現(xiàn)其在pH9.0時(shí)和37℃時(shí)活力最大。隨著變性劑尿素或SDS濃度的增加，重組蛋白TfGSTO的活性逐漸降低。
　　 松江鱸MGST3的cDNA序列全長(zhǎng)1076 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?65bp，編碼154個(gè)氨基酸。MGST3預(yù)測(cè)分子量為16.81 kD，理論等電點(diǎn)為9.39。松江鱸與其他已知魚(yú)類(lèi)的同源性在69.74％-76.13％之間，與兩棲類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳類(lèi)的同

9、源性在57.79％-62.34％之間。MGST3在檢測(cè)的各個(gè)組織中都有表達(dá)，LPS和重金屬刺激后，MGST3在主要免疫器官和腦中表達(dá)均明顯上調(diào)。成功構(gòu)建MGST3的原核表達(dá)載體(pET-30a(+)，在37℃下，IPTG誘導(dǎo)4h后，在E coli BL21(DE3)表達(dá)菌株中有較低表達(dá)量的約22 kD的目的蛋白。改變誘導(dǎo)溫度、時(shí)間以及IPTG濃度后，其目的蛋白的表達(dá)量均未得到提高。對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性檢測(cè)，測(cè)得其谷胱