J亞群禽白血病病毒AH-J11株全基因組序列分析及其感染性克隆的構建.pdf

1、禽白血病(Avian Leukosis,AL)是由C型禽反錄病毒引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱。主要引起雞的消瘦、生長發(fā)育不良和免疫抑制,此病在世界各國雞群中廣泛流行,是危害養(yǎng)雞業(yè)的重要傳染病之一。由于該病毒能夠通過水平傳播和垂直傳播的兩種方式擴散,現(xiàn)階段主要通過淘汰攜帶病毒和患病雞群,從而達到凈化種群的目的。
　　本研究根據(jù)GenBank上已發(fā)表的經典株HPRS-103株和SD07LK1株全基因序列,設計并合成11對特異性引物,

2、通過PCR方法將全基因組分為11個片段進行擴增,成功擴增出ALV-J安徽分離株AH-J11的全基因序列,并將其分別克隆至pMD18-T載體后進行序列測定、拼接,并與GenBank上發(fā)表的不同來源的國內外流行毒株進行核苷酸及其推導的氨基酸序列的同源性比較,分析遺傳變異關系,繪制遺傳進化樹。序列分析比對結果表明,AH-J11株的全長為7844nt,由3個主要的結構基因gag、pol、env和兩端的LTR組成;gag與pol基因為相對保守區(qū)域

3、,而env基因為病毒的主要變異區(qū),并且與HPRS-103株的全基因序列同源性最高,達到97.4％,遺傳親緣關系最近。研究結果補充和豐富了ALV-J的基因組信息數(shù)據(jù),為了解ALV-J遺傳變異關系及構建全基因感染性克隆奠定了基礎。
　　其次,采用融合PCR方法將全長11段序列融合至4段J亞群白血病病毒AH-J11株的前病毒cDNA,PCR產物經克隆后順次連接至pBluescript II SK+載體上,構建該分離株的感染性克隆(pBl

4、ALV-AH-J11),將pBlALV-AH-J11重組質粒純化后轉染雞胚成纖維細胞(CEF),拯救病毒,然后對拯救病毒(rALV-J)進行增殖培養(yǎng),連續(xù)傳代3次。分別利用RT-PCR、Western-blot和IFA方法,對拯救病毒進行鑒定。結果證明,本研究構建了AH-J11株的全基因組感染性克隆,并拯救出了具有感染性的病毒,為研究J亞群禽白血病病毒的致病機理和探討新的防制措施等提供了良好的ALV的反向遺傳操作技術平臺。
　　最

5、后,為構建以J亞型禽白血病病毒(ALV-J)的LTR元件為啟動子的真核表達載體,將ALV-JLTR克隆至pBluescriptIISK(+)載體中,并在5’LTR和3’LTR之間分別插入報告基因(eGFP)和新城疫病毒(NDV)的NP基因,得到重組質粒pSK-LTR-GFP和pSK-LTR-NP。將上述重組質粒分別轉染293T細胞、BHK-21細胞和雞胚成纖維細胞(CEF),應用RT-PCR、westernblot和熒光顯微鏡檢測目的基