嗜水氣單胞菌J-1株ahyI基因缺失株的構(gòu)建特性分析.pdf

1、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是哺乳動(dòng)物和水產(chǎn)動(dòng)物重要的條件致病菌，具有一系列的毒力因子，包括溶血素、腸毒素、細(xì)胞毒素、甘油磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶和絲氨酸蛋白酶等。有研究表明群體感應(yīng)系統(tǒng)可以調(diào)控毒力因子的產(chǎn)生。
　　 群體感應(yīng)系統(tǒng)1(QS1)廣泛存在于革蘭陰性菌中，AhyI是嗜水氣單胞菌QS1信號(hào)分子合成酶。本試驗(yàn)根據(jù)嗜水氣單胞菌ATCC7966的ahyI基因序列設(shè)計(jì)并合成引物，以嗜水氣單胞菌J-1株DNA

2、為模板進(jìn)行PCR的檢測(cè)和分析，可擴(kuò)增到952bp片段，通過(guò)Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與嗜水氣單胞菌ATCC7966及嗜水氣單胞菌SSU的ahyI基因同源性很高，分別為99％、96％。用PCR方法檢測(cè)ahyI基因在115株不同來(lái)源、不同地區(qū)氣單胞菌中的分布，結(jié)果表明22株嗜水氣單胞菌中檢出，陽(yáng)性率為100％，且特異性高，說(shuō)明ahyI基因在嗜水氣單胞菌中有一定的保守性。維氏氣單胞菌（A.veronii）ahyI基因的檢出率為50％(34/68)，

3、在14株溫和氣單胞菌(A.sobria)和7株庫(kù)蚊氣單胞菌(A.culicicola)中分別有9株和3株為陽(yáng)性。ahyI基因在健康、發(fā)病魚以及水體中沒(méi)有明顯的特征分布。
　　 根據(jù)嗜水氣單胞菌ATCC7966的基因組設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別擴(kuò)增嗜水氣單胞菌J-1株ahyI基因的上游870bp和下游920bp，將氯霉素基因插入上下游之間，構(gòu)建缺失ahyI基因的自殺性質(zhì)粒pHM5（ahyI）。將重組的自殺性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入EcoliSM10，用濾

4、膜接合法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入嗜水氣單胞菌J-1株，通過(guò)抗性以及蔗糖篩選出雙交換的缺失株，并利用pUC18載體構(gòu)建該基因的互補(bǔ)株。對(duì)缺失株、野生株及互補(bǔ)株的生物學(xué)特性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hyI基因缺失后，菌株不能合成AI-1，但對(duì)AI-2的影響不顯著。缺失株的胞外蛋白酶活性下降，通過(guò)SDS-PAGE比較發(fā)現(xiàn)，胞外蛋白圖譜與J-1株明顯不同;RT-PCR顯示，絲氨酸蛋白酶基因表達(dá)降低。與J-1株相比，缺失株對(duì)Hep2細(xì)胞的黏附力和對(duì)EPC細(xì)胞的侵