豬支氣管敗血波氏桿菌皮膚壞死毒素基因的原核表達及間接ELISA檢測方法的初步建立.pdf

1、由支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)引起的非進行性豬萎縮性鼻炎被認為是一種重要的上呼吸道疾病。該病可導致育肥豬生長遲滯，降低飼料的利用率，給世界畜牧業(yè)造成巨大的經濟損失。其主要的臨床癥狀為：鼻炎、鼻甲骨萎縮和顏面變形等。
　　 據報道，Bb和其菌相有致病性關系，其中強皮膚壞死毒素(dermonecrotic toxin，DNT)在I相菌中的毒力是最強的，具有不耐熱的短鞭毛和莢膜，毒力比

2、其他相菌的都強。該毒素是一種很主要的致病因子，由DNT基因編碼，在這個菌的致病過程中起著非常重要的作用。
　　 本研究針對Bb的DNT基因及其表達的產物開展了以下的工作：
　　 參照GenBank上已經發(fā)表的DNT基因序列，設計了三對引物，以本實驗室分離并保存的Bb菌株為實驗材料，用PCR等方法分三段克隆了Bb的DNT基因，再連接成與目的相符的全毒素基因。接著對全毒素基因序列進行測定。還選擇PET高效原核表達系統(tǒng)，構建了

3、重組表達質粒PET-DNT。結果顯示：目的基因有4395 bp左右，同GenBank上的其中的3個DNT基因序列相比，如下：U59687、E17214、AB020025相比，核苷酸的同源性達到99.2％以上。表明該基因不存在地域性的差別。同時表明dnt全毒素基因是十分保守的。
　　 接著將分段擴增的產物插入原核表達載體PET-28a中，成功構建了三個重組質?！癙ET-DNTN、PET-DNTu、PET-DNTc"。并通過PCR及

4、酶切鑒定等方法，均能得到基本與理論相符合的基因片段，表明這三個原核表達載體構建成功。研究二，將重組質?！癙ET-DNTN”轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經誘導獲得大小約33 kDa的表達蛋白(rDNTN)。
　　 以DNT基因5’端亞克隆表達產物rDNTN為抗原，初步建立一種間接ELISA方法，目的是檢測DNT抗體。用多次方陣滴定的方法來確定抗原的最佳包被濃度，最后確定為1.6 ug/ml、關于血清的最佳稀釋倍數也

5、用相同方法，為1:100，陰陽分界為OD630=0.313;該方法初步檢測了266份臨床送檢樣品，結果表明陽性率達到31.2％．
　　 為了能更好的研究毒素蛋白的一些生物學活性，通過健康豚鼠的皮膚壞死試驗來研究表達蛋白的生物學活性。結果顯示：表達產物和天然毒素相比較，DNT的皮膚壞死活性前者較低。Westem blot的結果則表明表達產物反應原性是良好的。
　　 本研究成功地克隆并表達了Bb菌株毒素DNT4395 bp基