果蔗對梢腐病病原菌Gibberella fujikuroi侵染的分子響應.pdf

1、果蔗具有很高的營養(yǎng)價值與經濟價值,是一種重要的經濟作物,在南方數省逐漸形成了具有一定規(guī)模的產業(yè)。在栽培生產以及貯藏的過程中,不同病害對果蔗的產量與品質造成了嚴重危害,給農民帶來了極大的經濟損失。我國果蔗種質資源十分豐富,其中也蘊藏著具有各種抗病性狀的栽培品種。但是,對于果蔗與不同病原之間互作機制的探討以及參與相關病理反應蛋白或基因的挖掘,相關研究詮釋與實際應用還很有限。本研究利用差異蛋白組學、實時螢光定量PCR與生理生化的方法初步探討果

2、蔗與梢腐病病原菌G fujikuroi之間互作的分子機制,并利用電子克隆與RT-PCR方法分離果蔗參與抗病途徑的信號傳導因子SGT1與RAR1的編碼基因,分析了果蔗SGT1與RAR1的編碼基因理化性質、基因拷貝數與受到G fujikuroi侵染誘導后的轉錄水平。利用這些研究結果對果蔗與梢腐病病原菌G fujikuroi之間互作的分子機制進行初步的解釋,并為果蔗的抗病育種提供一些物質基礎。主要研究結果如下：
　　 ⑴果蔗接種梢腐病

3、病原G.fujikuroi的葉片蛋白質差異表達分析。利用梢腐病病原菌G fujikuroi接種10個不同地區(qū)的果蔗栽培品種,表現出不同程度的發(fā)病癥狀。果蔗“白鱔”、“肚度”、“豐城紫皮”與“拔地拉”表現的癥狀比較輕;其它地區(qū)果蔗栽培品種“夏茂”、“溫嶺”、“寧德”、“嵊縣”與“歪干擔”的葉片癥狀表現明顯,病斑狹長,面積大,并出現壞死部位;果蔗“福安”葉片的癥狀表現為中等程度。選擇果蔗福安作差異蛋白組學分析,分別在0h與48h時提取葉片蛋

4、白,通過蛋白質雙相電泳構建蛋白質圖譜。通過ImageMaster軟件分析,確定24個差異蛋白點,利用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF/MS)進行分析,獲得肽質量指紋圖譜,根據數據庫進行查詢及蛋白質鑒定。所鑒定的24個蛋白中可以初步分為5類,分別是參與果蔗病理反應的相關蛋白、抗氧化系統(tǒng)的防衛(wèi)相關蛋白、抗性蛋白、抗氧化系統(tǒng)的防衛(wèi)相關蛋白、激酶類蛋白與其它蛋白。這些蛋白可能參與了果蔗與梢腐病病原菌Gfujikuroi之間的

5、病理反應,但是它們在病理反應所產生的網絡中發(fā)揮的功能與作用機理有待進一步的探討。
　　 ⑵梢腐病病原G fujikuroi侵染果蔗葉片相關生理指標的研究。為了初步驗證差異表達蛋白在果蔗與梢腐病病原菌G fujikuroi互作時的表達情況,從所鑒定的24個蛋白中選擇超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)與幾丁質酶(CHIT)以及相關指標過氧化氫酶(CAT)與丙二醛(MDA)進行研究。研究結果表明,這些指標的變化趨勢相似,都

6、是呈“先升后降”的表達模式。在不同地區(qū)果蔗栽培品種的葉片中,SOD、POD、CAT、與CHIT活性以及MDA含量存在著很大的差異,說明了不同果蔗栽培品種在生理水平上對于梢腐病病原菌G fujikuroi的反應是不相同的,并在不同程度上限制了梢腐病病原菌G fujikuroi的進一步擴展。
　　 ⑶病程相關蛋白基因表達的實時定量RT-PCR分析。在差異蛋白組學與生理生化的研究基礎上,選取了SOD、POD、CHIT以及在差異蛋白組學

7、中呈下降表達的海藻糖-6-磷酸合酶(TPS6P)作為對象,根據同源基因設計簡并引物,進行qRT-PCR研究分析。qRT-PCR所擴增出的片段序列經過測序比對,結果表明所得到基因片段的序列信息是正確的,分別命名為SoSOD、SoCHIT、SoPOD與SoTPS6P,在GeneBank中的登錄號為GU219845～GU219848。SoSOD、SoCHIT與SoPOD在不同果蔗葉片中受到梢腐病病原菌G fujikuroi誘導后總體上呈上調表

8、達,SoTPS6P先是出現上調表達后再呈現下調表達。qRT-PCR分析結果表明梢腐病病原菌引起果蔗病程相關蛋白編碼基因轉錄水平的變化,為其在相應的代謝途徑中的調節(jié)作用提供一些理論依據。
　　 ⑷果蔗防衛(wèi)相關基因SoSgtl與SoRarl的克隆與特征分析。根據已克隆的其他植物的SGT1與RAR1基因的保守序列設計引物,從果蔗福安葉片中獲得了SGT1與RAR1類似基因片段,利用電子克隆與RT-PCR驗證,得到果蔗SGT1與RAR1的

9、全長基因cDNA序列,分別命名為SoSgtl與SoRarl,在GeneBank中的登錄號為GQ864255與GQ864256。SoSgtl具有1086個堿基的開放閱讀框,編碼362個氨基酸,含有SGT1基因典型的TPR、CS和SGS結構域。SoRarl包含645個堿基的開放閱讀框,編碼215個氨基酸,具有CHORDⅠ、CCCH和CHORDⅡ結構域。與其它植物SGT1和RAR1基因編碼的氨基酸序列進行比較分析表明,果蔗SoSgtl與SoR

10、arl的氨基酸序列與其它作物之間具有很高的保守性,含有起到關鍵功能作用的保守區(qū)域。Southern雜交結果表明,SoSgtl與SoRarl在果蔗中具有1-2個拷貝。利用半定量RT-PCR研究果蔗受G fujikuroi誘導時SoSgtl與SoRarl的表達情況,結果表明果蔗SoSgtl與SoRarl的表達量得到提高,而且不同地區(qū)栽培品種葉片中表達存在著很大的差異。分別構建果蔗SoSgtl與SoRarl的植物反義真核表達載體,并初步進行了