多重PCR方法鑒別診斷禽腫瘤性病毒感染.pdf

1、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(Reticuloendotheliosis Virus，REV)、馬立克氏病病毒(Marek's disease viruses，MDV)禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)均可引起禽類的腫瘤性疾病和免疫抑制性疾病。這三種禽腫瘤性疾病都可以導(dǎo)致不同程度的二重感染、多重感染以及繼發(fā)感染，會(huì)減弱雞群對(duì)各種疫苗的免疫應(yīng)答能力，加劇一些疾病的臨床癥狀。目前，對(duì)三種腫瘤性疾病并沒有有效的治療藥

2、物，對(duì)REV和ALV也沒有疫苗可以進(jìn)行防御，所以，世界各國主要通過抗原/抗體檢測(cè)，淘汰陽性雞，凈化種群，對(duì)MD進(jìn)行免疫等防治措施來控制這三種禽腫瘤性疾病。
　　由于這三種病臨床常混合感染，增加了其臨床快速診斷的難度，而目前常規(guī)的診斷方法，例如血清學(xué)診斷方法，病毒分離方法，病理組織切片觀察法等都存在著敏感度低，耗時(shí)較長的不足，已經(jīng)不能滿足現(xiàn)實(shí)臨床診斷的要求。多重PCR方法具有敏感性高而且能夠一次檢測(cè)多種病原的優(yōu)勢(shì)，更加適用于現(xiàn)在混合

3、感染的臨床快速診斷。
　　本研究采用依據(jù)四種病毒的保守基因而設(shè)計(jì)的特異性引物，合成了四對(duì)分別用于擴(kuò)增REV、MDV、ALV-J和ALV-A病毒基因的引物，然后通過優(yōu)化多重RT-PCR的實(shí)驗(yàn)條件，建立了能夠同時(shí)檢測(cè)四種病毒病的多重RT-PCR方法并初步對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。將從REV/ALV-A/J感染細(xì)胞中提取的總RNA和MDV陽性病料中的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并測(cè)定濃度，分別調(diào)整到同一濃度后等比例混合作為PCR反應(yīng)的模板。首先用

4、梯度PCR儀對(duì)四重引物和四重模板在50℃～58℃溫度下進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，選擇最優(yōu)退火溫度;然后對(duì)多重RT-PCR的最低模板量和最佳引物濃度進(jìn)行確定和優(yōu)化，先分別101～106倍稀釋模板，進(jìn)行多重RT-PCR反應(yīng)確定最低模板量;然后以引物濃度為變量進(jìn)行多重PCR反應(yīng)選擇最佳引物濃度;然后在設(shè)定的不同循環(huán)次數(shù)（25～45次）中選擇最優(yōu)反應(yīng)循環(huán)次數(shù);都優(yōu)化完成后通過調(diào)整模板內(nèi)容進(jìn)行單重、二重、三重和四重PCR的特異性反應(yīng)試驗(yàn)，最后測(cè)試多重

5、PCR體系的可重復(fù)性。體系建立后應(yīng)用于山東地區(qū)（濰坊、泰安、德州、威海、菏澤、濟(jì)南、青島等地）送檢實(shí)驗(yàn)室的58份病雞臨床病例。
　　本研究取得如下結(jié)果:多重RT-PCR的特異性試驗(yàn)表明，該方法可以分別從REV、MDV、ALV-J和ALV-A的病毒混合物中擴(kuò)增出大小分別為292bp、434bp、545bp和692bp的目的片段;敏感性試驗(yàn)顯示，該多重RT-PCR的最低檢測(cè)模板量可達(dá)60pg，可重復(fù)性試驗(yàn)則顯示，該RT-PCR方法具有

6、良好的重復(fù)性。然后，在58份臨床病例的檢測(cè)中REV陽性率為55％(32/58)，MDV陽性率為10％(6/58) ALV-J陽性率為3％(2/58)，ALV-A陽性率為7％(4/58)，其中REV與MDV雙重感染占3％(2/58)，REV與ALV-A雙重感染占9％(5/58)，REV、MDV和ALV-A三重感染占2％(1/58)，此次檢測(cè)未見到四種病毒在同一只雞機(jī)體上共同感染的現(xiàn)象。
　　本研究建立了針對(duì)REV、MDV、ALV-J