抗雞CD8α單克隆抗體的研制與初步應用.pdf

1、單克隆抗體一直以來都被作為研究T淋巴細胞表面分子的重要工具。國外研制的雞CD分子的單克隆抗體為研究免疫細胞的生理功能及細胞表面標志的生物學作用等創(chuàng)造了有利條件，他們可以利用這些單克隆抗體對淋巴細胞進行分選，以研究免疫應答類型；或用于消耗動物體內(nèi)相應的CD分子，以研究CD分子在體內(nèi)的作用；也可用于研究CD分子的結(jié)構(gòu)、功能等。本實驗旨在研制特異性的抗雞CD8α的單克隆抗體，特別是適用于間接免疫熒光試驗、細胞分析與分選等流式細胞術的單克隆抗體

2、。
　　 研究中首先利用淋巴細胞分離液制備白萊航雞脾臟和胸腺的淋巴細胞，接著用制備的淋巴細胞免疫3只6周齡的雌性BALB/c小鼠。在經(jīng)過兩次免疫后，眼靜脈竇采血，分離血清，應用間接免疫熒光試驗測定血清效價。達到1∶1280后，進行加強免疫。3天后，無菌條件下取BALB/c小鼠的脾臟細胞與培養(yǎng)到對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0在PEG4000的作用下進行融合。5天后添加新鮮的HAT培養(yǎng)基，10天后更換HT培養(yǎng)基。待融合細胞上

3、清變黃后即可進行陽性克隆的篩選。
　　 采用間接免疫熒光染色結(jié)合FACS分析篩選陽性克隆。應用本室構(gòu)建的穩(wěn)定表達雞CD8α的細胞系Flp-in-293-CD8α-FLAG與雜交瘤上清進行間接免疫熒光染色，通過流式細胞術檢測熒光率篩選出陽性雜交瘤克隆。同時設立商品化的純化的鼠抗雞CD8α抗體的陽性對照。再經(jīng)過2次有限稀釋法亞克隆，篩選到了一株穩(wěn)定分泌抗雞CD8α的單克隆抗體的雜交瘤細胞，命名為6E5。將雜交瘤細胞6E5腹腔注射預先

4、用石蠟處理的BALB/c小鼠，制備6E5腹水。間接免疫熒光FACS試驗測定腹水效價，達到1∶1204000。應用抗原介導的ELISA方法，測得6E5的亞類為IgG1。
　　 應用CD3/CD8雙色免疫熒光結(jié)合FACS分析進一步鑒定單克隆抗體。取白萊航雞的脾臟淋巴細胞，第一步通過間接染色的方法標記6E5抗鼠FITC,第二步通過直接染色的方法標記CD3-PE。同時設立商品化的純化的鼠抗雞CD8α抗體為一抗的陽性對照。結(jié)果顯示，6E5

5、是一株分泌抗雞CD8α的單克隆抗體的雜交瘤細胞。
　　 將6E5與商品化的鼠抗雞CD8α抗體(CLONE∶CT8)進行抗原表位的比較。取白萊航雞的淋巴細胞，加入不同含量的6E5雜交瘤細胞制備的腹水，接著加入相應含量的CD8-PE(CLONE∶CT8)。如果6E5與商品化的鼠抗雞CD8α抗體(CLONE∶CT8)是識別相同的表位，那么隨著6E5腹水量的升高，熒光率應該降低。但是實驗的結(jié)果表明，熒光率不隨著6E5濃度的升高而降低，說

6、明兩者不是針對同一抗原表位。
　　 應用單克隆抗體6E5測定與白萊航品系雞不同組織中淋巴細胞的反應性。取白萊航雞的胸腺、脾臟、法氏囊淋巴細胞，與6E5腹水分別反應。結(jié)果表明，6E5可以識別胸腺、脾臟淋巴細胞里表達CD8 T淋巴細胞。但是不與法氏囊淋巴細胞反應，這主要是因為法氏囊淋巴細胞是B淋巴細胞。
　　 應用單克隆抗體6E5測定與不同品種(系)的家禽的淋巴細胞的反應性。選取隱性白羽雞、石岐雜雞、狼山雞、安卡雞、龍溪麻雞

7、、康貝爾鴨、鴉鴨、揚州鵝八種家禽，分別采集外周血，制備外周血淋巴細胞，測定6E5與不同品系的家禽的淋巴細胞的反應性。結(jié)果顯示，6E5可以特異的識別雞的外周血淋巴細胞中表達CD8的T淋巴細胞，不能識別康貝爾鴨、鴉鴨、揚州鵝外周血淋巴細胞。
　　 在雞的免疫試驗中，進一步應用單克隆抗體6E5測定了不同免疫組的雞的免疫水平。
　　 利用本室構(gòu)建的豬霍亂沙門菌C500△asd(pYA3334)菌株、豬霍亂沙門菌C500△asd(

8、pYA3334-F)菌株免疫20日齡海蘭白雞，同時設立不免疫的陰性對照。在第一次免疫后14天、第二次免疫后7天、第二次免疫后14天，分別取不同免疫組的海蘭白雞，制備脾臟淋巴細胞，利用間接方法標記6E5抗鼠PE。再標記CD4-FITC，流式細胞儀檢測CD4與CD8百分含量。同時設立商品化鼠抗雞CD8α抗體的陽性對照。通過CD4與CD8的百分含量的比值判斷不同免疫組的白萊航雞的免疫水平。6E5測得的結(jié)果與商品化的鼠抗雞CD8α抗體得到的結(jié)果