甘藍型油菜及其親本物種TTG1和TT18基因家族的克隆與比較基因組學研究.pdf

1、甘藍型油菜是世界上種植最廣泛的油料作物之一，在我國農業(yè)生產中也占有重要地位，傳統(tǒng)的甘藍型黑籽油菜具有抗病蟲、抗倒伏、油菜籽產量高等優(yōu)點。但其籽粒的含油量偏低，芥酸、硫代葡萄糖甙、多酚類物質以及色素等含量偏高。榨出的油色澤深，烹調時油煙多，而且芥酸不易被人體消化吸收，營養(yǎng)價值低，餅粕中的硫代葡萄糖甙的水解產物對牲畜有毒。因此，提高甘藍型油菜籽粒的含油量，降低菜油中的芥酸、硫代葡萄糖甙、多酚類物質以及色素等的含量，改善菜籽油的品質，是油菜育

2、種的重要目標。本研究克隆了甘藍型油菜、甘藍、白菜TTG1和TT18基因家族的全長序列，對序列進行了系統(tǒng)的生物信息學分析和功能比較基因組學分析，對3個物種的黑、黃籽材料間TTG1，TT18表達差異進行了研究。主要研究內容及結果如下：
　　 ⑴采用RACE技術，克隆了甘藍型油菜、甘藍、白菜TTG1基因家族各2個成員的全長cDNA和對應的全長基因組序列。甘藍犁油菜BnTTG1—1、BnTTG1—2的全長基因組序列分別為1511bp、1

3、555bp，典型的全長mRNA[不計Ploy(A)尾巴，下同]分別為1355bp和1303bp。甘藍BoTTG—2的全長基因組序列為1594bp，BoTTG1—1、BoTTG1—2的典型全長mRNA分別為1355bp和1404bp。白菜BrTTG1—1、BrTTG1—2的全長基因組序列分別為1656bp、1541bp，它們典型的全長mRNA分別為1478bp和1364bp。
　　 ⑵推導的BnTTG1—1、BnTTG1—2、Bo

4、TTG1—1、BoTTG1—2、BrTTG1—1、BrTTG1—2蛋白均為337個氨基酸殘基，分子量(Mw)分別為37.28、37.26、37.27、37.31、37.28和37.20kD，等電點(pI)均為4.66，都為酸性蛋白。它們均以絲氨酸最豐富，酸性氨基酸多于堿性氨基酸。用NetPhos2.0預測它們都存在較多的潛在磷酸化位點，BnTTG1—1、BoTTG1—1和BrTTG1—1都有26個，BnTTG1—2和BrTTG1—2均有

5、25個，BoTTG1—2有27個。所以磷酸化可能參與它們的蛋白活性調節(jié)。均沒有預測到它們存在信號肽和跨膜域，預測它們均可能定位于細胞質內。用SOPMA對蕓薹屬TTG1家族蛋白二級結構進行預測表明，各TTG1蛋白成員的二級結構非常相似，主要由延伸鏈(Extended strand)和隨機卷曲(Random coil)構成，其中隨機卷曲所占比例最高，β轉角(Beta turn)不足10％，α螺旋很少。蕓薹屬TTG1蛋白和AtTTG1蛋白二級

6、結構很相似，整個分子分布大量的隨機卷曲。未能預測出這些蛋白質的三級結構。
　　 ⑶BnTTG1—1和BrTTG1—2之間有著極高的同源性，基因組序列和編碼區(qū)序列的一致性分別達到97.2和99％。BnTTG1—2和BoTTG1—1之間也具有極高的同源性，mRNA核苷酸序列和編碼區(qū)序列的一致性分別達到98.7％和98.3％。此外，從內含子的一致性、5’UTR中的AG重復序列的位置與長度、基因序列中的特征性變異堿基、氨基酸序列中的特征

7、性變異氨基酸等方面，都表明BnTTG1—1對應于BrTTG1—2，BnTTG1—2對應于BoTTG1—1，說明甘藍和白菜的確為甘藍型油菜提供了遺傳物質。本研究從功能基因家族成員的全長序列比較克隆的角度，為揭示甘藍型油菜與其親本物種間的進化關系提供了直觀而具體的分子證據。
　　 ⑷TTG1蛋白在蛋白水平具有極度保守性。蕓薹屬TTG1基因在基因組水平以及編碼區(qū)有一定的差異，但是他們在蛋白水平上有著非常高的同源性，一致性為98.50％

8、～100％，相似性為99.1％～100％。同時它們與AtTTG1也具有很高的同源性，一致性為92.4％～93.0％，相似性為95.04％～95.9％。蕓薹屬TTG1基因與單子葉植物也具有很高的同源性，甚至與人和動物的相應蛋白也具有很高的同源性，尤其是在蛋白的中段以及C端十分保守，這一保守性主要表現在物種間編碼區(qū)的高度保守性以及相似氨基酸的取代。這種趨勢主要在看家基因以及一些重要的結構基因中發(fā)現，而轉錄因子的分化一般比結構基因快。雖然TT

9、G1基因編碼轉錄因子，但它的保守性甚至超過了一些結構基因。
　　 ⑸采用RACE技術，分別克隆了甘藍型油菜、甘藍、白菜TT18基因家族5、2、3個成員的全長cDNA和對應的全長基因組序列。甘藍型油菜BnTT18—1、BnTT18—2、BnTT18—3、BnTT18—4、BnTT18—5的全長基因組序列分別為1875bp、1508bp、1897bp、1972b、1491bpp，典型的全長mRNA(不計Ploy(A)尾巴，下同)分別

10、為1481bp、1421bp、1477bp、1279bp、1404bp。甘藍BoTT18—1、BoTT18—2的全長基因組序列分別為1923bp、1491bp，典型的全長mRNA分別為1482bp、1404bp。
　　 ⑹推導的BnTT18—1、BnTT18—3、BnTT18—4、BnTT18—5、BoTT18—1、BoTT18—2、BrTT18—1、BrTT18—2、BrTT18—3編碼337～338個氨基酸殘基的蛋白，分子量

11、(Mw)分別為40.86、40.86、40.83、40.89、、40.86、40.86、40.84、40.87、40.77、40.86kD，等電點(pI)為5.13～5.30，都為酸性蛋白，均以谷氨酸最豐富，酸性氨基酸多于堿性氨基酸。用NetPhos2.0預測它們都存在較多的潛在磷酸化位點，BnTT18—1、BnTT18—3、BnTT18—4、BnTT18—5、BoTT18—1、BoTT18—2、BrTT18—1、BrTT18—2、Br

12、TT18—3的位點數分別為10、13、12、7、10、7、13、7、7，所以磷酸化可能參與它們的蛋白活性調節(jié)。它們均沒有預測到信號肽和跨膜域，預測它們均可能定位于細胞質內。
　　 ⑺BnTT18—1與BoTT18—1之間有著極高的同源性，基因組序列和編碼區(qū)序列的一致性分別達到97.5％和99.0％。BnTT18—2與BrTT18—2之間有著極高的同源性，基因組序列和編碼區(qū)序列的一致性分別達到95.3％和95.6％。BnTT18—

13、3與BrTT18—1之間有著極高的同源性，基因組序列和編碼區(qū)序列的一致性分別達到99.3％和99.0％。BnTT18—5與BrTT18—3之間有著極高的同源性，基因組序列和編碼區(qū)序列的一致性分別達到100％和100％。其種間基因的一致性高于甘藍型油菜種內成員之間的一致性。因此，BnTT18—1來自于甘藍的BoTT18—1，BnTT18—2來自于白菜的BrTT18—2，BnTT18—3來自于白菜的BrTT18—1，BnTT18—5來自于白