家蠶濃核病毒BmDNV-1(伊那)株結(jié)構(gòu)蛋白基因VP4的克隆表達及抗體制備.pdf

1、細小病毒科根據(jù)病毒的宿主不同，分成兩個亞科，即感染脊椎動物的細小病毒亞科（Parvovirinae）和感染無脊椎動物的濃病毒亞科（Densovirinae）。其特征是病毒粒子無囊膜，直徑約18～26nm，二十面體對稱，衣殼由約32個長3～4nm的殼粒構(gòu)成。病毒內(nèi)含有正負鏈單分子ssDNA，極性或為正鏈，或為互補的負鏈。 濃核病毒（Densoviruses，DNVs）亞科有分為4個屬，即濃核病毒屬（Densovirus）、短病毒屬

2、（Brevidensovirus）、重復(fù)病毒屬（Iteravirus）和環(huán)星黑煙濃核病毒屬（Pefudensovirus）。其病毒基因組為單鏈，線型的DNA，大小約4～6 kb，末端反向重復(fù)形成反轉(zhuǎn)回文結(jié)構(gòu)，其中基因組末端的反轉(zhuǎn)互補的回折部分是細小病毒DNA復(fù)制的引物。家蠶濃核病毒Bombyx mori densovirus（BmDNV-1）伊那株是一種昆蟲細小病毒，屬重復(fù)病毒屬，濃核病毒亞科?；蚪M結(jié)構(gòu)非常簡單，僅由結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋

3、白兩個基因組成，是一個非常理想的研究病毒基因調(diào)控的模式病毒。 本文采用PCR技術(shù)，根據(jù)已知家蠶濃核病毒BmDNV-1（伊那株）的結(jié)構(gòu)蛋白VP4基因設(shè)計上游引物和下游引物，并將該基因與原核表達載體pMAL-c2X分別進行雙酶切，然后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，通過酶切鑒定陽性克隆。經(jīng)序列分析表明，該基因編碼區(qū)全長1462 bp，編碼487個氨基酸殘基，預(yù)計分子量為54000。 將測序鑒定正確的陽性克隆命名為pMAL-c2

4、X-VP4，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10B感受態(tài)細胞中，IPTG誘導(dǎo)表達融合蛋白，用抗MBP抗體檢測目的蛋白，Westen-blotting試驗證明所表達的蛋白是帶有MBP-tag的融合蛋白。通過改變IPTG濃度和誘導(dǎo)時間，對表達條件進行了優(yōu)化，確定最佳表達時間為3.5h，且當(dāng)IPTG濃度為0.7 mmol/L時，融合蛋白表達量接近最大。 利用Amylose親和層析柱純化目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE鑒定為單一條帶，純度可達90％以上。