水稻NAC轉(zhuǎn)錄因子家族NAP基因的克隆及其功能研究.pdf

1、水稻是我國(guó)目前種植面積最廣的農(nóng)作物之一，而葉片又是水稻最重要的營(yíng)養(yǎng)器官，水稻籽粒中有2/3以上的干物質(zhì)是開花后通過(guò)光合作用獲得的，因此葉片的功能及衰老對(duì)水稻產(chǎn)量有重要影響。近年來(lái)轉(zhuǎn)錄因子已被研究證明在植物分子育種中具有巨大的潛在價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。NAC轉(zhuǎn)錄因子是近十幾年來(lái)已被證明在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程如胚發(fā)育、側(cè)根形成、花發(fā)育等，植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)如生長(zhǎng)素信號(hào)通路等，植物抵御生物脅迫以及非生物脅迫中都有著重要的作用。NAC轉(zhuǎn)錄因子家族基因At

2、NAP已經(jīng)被證明在擬南芥中可以延緩葉片衰老，但該基因在水稻中還未見其與作物生物量相關(guān)的報(bào)道。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)和遺傳分析手段的有力結(jié)合，將會(huì)分離鑒定出更多的對(duì)植物改良有重大意義的轉(zhuǎn)錄因子，為進(jìn)一步選育和改良植物的新品種奠定了堅(jiān)實(shí)的工作基礎(chǔ)。
　　 本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析從水稻日本晴(Oryza sativa L.)的基因組中克隆到一個(gè)與擬南芥衰老相關(guān)的基因AtNAP(Atlg69490)的同源基因OsNAP(Os03g032780

3、0)，為進(jìn)一步研究OsNAP的功能，運(yùn)用嵌合式顯性抑制技術(shù)，抑制下游靶基因的表達(dá)。使用顯性抑制元件SRDX構(gòu)建了pCAMBIA1304-35S：OsNAP-SRDX表達(dá)載體。通過(guò)農(nóng)桿菌浸染方法將pCAMBIA1304-35S：OsNAP-SRDX表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至水稻中花11品種。通過(guò)潮霉素、Real-timePCR及Western-Blot等方法鑒定獲得了具有表型的轉(zhuǎn)基因株系4株，并且對(duì)轉(zhuǎn)基因株系的農(nóng)藝性狀進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。主要研究結(jié)果如下

4、：⑴NAC轉(zhuǎn)錄因子OsNAP的克隆。根據(jù)軟件獲得的序列設(shè)計(jì)兩對(duì)特異引物，從水稻日本晴的基因組DNA克隆了OsNAP基因。測(cè)序結(jié)果表明OsNAP的ORF為1179bp，推測(cè)其編碼蛋白含有392個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為8.55，分子量為42.195KDa。⑵植物表達(dá)載體的構(gòu)建。將OsNAP與顯性抑制元件SRDX融合構(gòu)建了由組成型啟動(dòng)子2X35S驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體pCAMBIA1304-OsNAP-SRDX和pCAMBIA1304-OsNAP，將它

5、們導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果正確，可用于后續(xù)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化。⑶水稻的遺傳轉(zhuǎn)化。以水稻中花11品種為受體材料，通過(guò)農(nóng)桿菌浸染方法將含有pCAMBIA1304-35S：OsNAP-SRDX植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因水稻中花11品種，目前已經(jīng)獲得有表型的轉(zhuǎn)基因植株。⑷轉(zhuǎn)基因株系的評(píng)價(jià)。通過(guò)轉(zhuǎn)基因過(guò)程獲得的T0代轉(zhuǎn)基因株系，經(jīng)過(guò)潮霉素鑒定選擇陽(yáng)性植株種入大田進(jìn)行培養(yǎng)。待T0代成熟后，對(duì)其種子發(fā)苗通過(guò)Realtime PCR和Western