矮牽牛PMADS9基因的啟動子克隆與功能分析.pdf

1、MADS-box基因是一類廣泛存在于植物中的同源異型基因，在生物體不同的組織以及生長發(fā)育的不同階段都存在MADS-box基因的表達，它屬于一個古老的基因家族，是植物生長發(fā)育過程中重要的調控因子。目前對MADS-box基因調控機理的研究已成為植物分子生物學領域中的一大熱點。矮牽牛PMADS9基因是MADS-box基因AGL15亞家族的成員，該亞家族基因可能具有調控開花時間、抑制花器官衰老脫落和促進體胚形成等功能。
　　 通過RAC

2、R技術和YADE法，我們分別從矮牽牛小花蕾RNA和葉片DNA基因組中克隆得到了PMADS9基因的編碼區(qū)(GenBank登錄號：DQ418547)和5’端翻譯起始位點(ATG)上游1053bp的啟動子序列(GenBank登錄號：FJ798977)。然后在兩端設計引物，利用PCR技術從基因組DNA中擴增得到了全長基因序列共5861bp(GenBank登錄號為EU338501)。RACE分析發(fā)現該基因至少有4個轉錄起始位點(TSS)，2個位于

3、編碼區(qū)第一外顯子內。
　　 本研究，繼續(xù)克隆了PMADS9基因上游未知的啟動子區(qū)域，獲得了更長的800bp序列，并對該啟動子的功能進行了初步地研究，這對于進一步了解PMADS9基因表達調控的特點，以及更深入研究矮牽?；ㄆ鞴侔l(fā)育的分子機理都有著重要的意義。
　　 本文所取得的主要實驗結論如下：
　　 1.在已獲1053bp啟動子序列的基礎上，利用hiTAIL-PCR技術對矮牽牛PMADS9基因上游未知啟動子序列進行

4、了再擴增，獲得了更長的800bp啟動子片段，用SeqMan軟件對新獲取的序列與原有1053bp序列進行了拼接，最終獲得了PMADS9基因全長啟動子序列1853bp。
　　 2.運用PLACE和PlantCare等在線分析軟件對該序列進行了預測分析，該啟動子除了具有TATA-box和CAAT-box等基本轉錄元件外，還富含花粉和種子發(fā)育過程中特異表達所需的調控元件，以及與環(huán)境應答相關的各種順式調控元件。FootPrinter分析表

5、明，AGL15同源基因啟動子之間存在非常保守的RY-repeat元件，啟動子的保守性與物種的遺傳距離不一致；推測PMADS9基因翻譯起始位點(ATG)上游200～400bp和800～1000bp區(qū)域具有重要的功能。
　　 3.應用PCR技術對啟動子序列進行5’缺失；用各缺失片段替換表達載體pCAMBIA1305.1中的CaMV35S組成型啟動子序列，與GUS報告基因連接，成功構建了所有缺失重組表達載pCAMBIA1305.1空載

6、為陽性對照，轉化矮牽牛V1。GuS染色與PCR鑒定表明，成功實現了各表達載體對矮牽牛的穩(wěn)定遺傳轉化，獲得了陽性轉基因植株。
　　 4.待移栽后的轉基因植株開花后，對其進行GUS組織化學染色分析，結果表明全長啟動子序列(1853bp)轉化后的陽性植株，在莖、營養(yǎng)葉、苞葉以及花萼中幾乎檢測不到GUS活性；GUS基因在雄蕊、雌蕊、子房中有較高的表達豐度，在花瓣中也有一定豐度的表達，這與之前PMADS9基因表達分析的結果基本一致。在轉基