水稻白葉枯病菌Harpin-,Xoo-單克隆抗獨特型抗體的制備、篩選及其“內(nèi)影像”特性研究.pdf

1、位于革蘭氏陰性植物病原細菌染色體上的hrp基因簇決定其在非寄主植物上的過敏反應和在寄主植物上的致病性。Hrp基因簇包括編碼Ⅲ型泌出通道的基因、調(diào)節(jié)基因和編碼效應蛋白的基因。Harpins是由革蘭氏陰性植物病原細菌產(chǎn)生并受hrp基因調(diào)節(jié)的一類非特異性激發(fā)子，具有共同的特征：富含甘氨酸、對熱穩(wěn)定對蛋白酶K敏感。它們通過Ⅲ型泌出通道分泌到細胞膜外并轉運到寄主植物的細胞質中，能夠在寄主植物上引起致病性，在非寄主植物上引起過敏反應，誘導植物抗病，

2、抗蟲，促生長以及提高作物的產(chǎn)量與改善作物品質。HarpinXoo是由水稻白葉枯病菌Xanthomonas oryzaepv.oyzae的hrf1基因編碼的蛋白質，大小為139個氨基酸(15.6kDa)，具有與其它harpins類似的生物學活性，但在結構和組成上，它顯示一些其它harpins不具有的獨特性質，如含有其它harpins不具備的半胱氨酸等。
　　 植物擁有一套天然的免疫系統(tǒng)，使得它們能夠抵御外界病原物的侵染。高等植物的

3、HR，快速在病原物侵染點形成壞死斑，死亡細胞可以將侵入寄主體內(nèi)的病原物限制在侵染點周圍，阻止病原物的進一步擴展而實現(xiàn)局部抗病性，是植物針對多種病原物的主動防御，可進一步激活植物抗病防衛(wèi)信號通路，使植物獲得對此后侵入的多種類型病原物的系統(tǒng)抗病性（systemic acquired resistance， SAR）。當harpin被注射到非寄主植物葉片中時，最顯著的特征就是引起過敏反應，而harpin的活性位點是如何被植物細胞識別，在什么部

4、位識別，目前還不清楚。在本研究中，我們引入了一種研究植物-病原菌互作的新方法，應用基于Jerne的免疫網(wǎng)絡學說制備出的單克隆抗獨特型抗體模擬harpin的活性位點，探索harpin在非寄主植物中受體。本論文著重對以下幾方面進行了研究。
　　 1 HarpinXoo蛋白的提取與純化
　　 在本研究中，作者從水稻白葉枯病菌PXO99基因組DNA中擴增出hrf1基因，用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切，隨后插入到到pET30a(+)

5、載體的NdeⅠ和HindⅢ兩酶切位點之間，獲得了重組質粒pET30a(+)-hrf1，轉化宿主菌BL21(DE3)表達融合蛋白。表達菌株E.coli BL21/pET-hrf1在37℃，225rpm經(jīng)1mM IPTG誘導培養(yǎng)3小時后收集菌體，在100℃沸水中煮10分鐘，提取HarpinXoo蛋白，離心分離菌體，蛋白溶解在提取緩沖液中。SDS-PAGE電泳分析表明，獲得了大小為16.8kDa蛋白質。注射煙草葉片，引起過敏反應，說明提取到的

6、蛋白為Harpin。用Ni柱對粗蛋白進行純化，最終獲得了單一條帶的Harpin蛋白。
　　 2兔源多克隆抗-Harpinxoo抗體(Ab1)的制備與純化
　　 500μg純化的HarpinXoo溶解于滅菌的PBS中，與等體積的福氏完全佐劑混合乳化后皮下多點注射與肌肉注射交叉免疫新西蘭大白兔，隨后的加強免疫用200μg抗原與福氏不完全佐劑混合乳化，每兩周免疫一次。六周后，采集兔血清用間接ELISA法測定效價，以免疫前三天采

7、集的陰性血清作對照。ProteinA/G親合層析柱純化兔源多克隆抗血清，獲得多克隆抗-HarpinXooIgG。HarpinXoo注射煙草引起的過敏反應能被兔源多克隆抗體Ab1抑制，甚至完全阻止，說明Ab1結合harpin的一個或多個活性位點，而這些活性位點可能是非寄主植物中受體的結合位點。
　　 3體外、體內(nèi)都具有抑制活性的單克隆抗-Harpinxoo抗體的制備
　　 Balb/c小鼠接受四次免疫注射純化的Harpin

8、Xoo后，選取效價最高的一只小鼠做融合，制備雜交瘤細胞。間接ELISA法篩選，有限稀釋法亞克隆，兩輪篩選后獲得6株單克隆抗HarpinXo雜交瘤細胞(2A10、3H12、4B2、4F7、6G4、7F11)。ELISA疊加實驗表明，HarpinXoo上的四個表位被6株單克隆細胞株所識別，其中被6G4識別的表位為HarpinXoo引起煙草過敏反應活性位點。體外研究表明，6G4能夠與煙草葉片總蛋白競爭性地結合HarpinXoo，最重要的是在體

9、內(nèi)，6G4能夠部分抑制HarpinXoo引起的煙草過敏反應。6G4顯然為一個非常合適的免疫原來制備具有Harpinxoo活性位點“內(nèi)影像”特征的抗獨特型抗體。闡明6G4在體外、體內(nèi)的反應特性將有助于鑒定引起煙草過敏反應的harpin的關鍵區(qū)域。
　　 4具有HarpinXoo“內(nèi)影像”特征的抗獨特型抗體的制備與特性分析
　　 用固定化的胃蛋白酶消解純的兔源多克隆抗體Ab1獲得F(ab＇)2片段，具有抗原結合活性的F(ab

10、＇)2被用作免疫原來制備具有HarpinXoo“內(nèi)影像”特征的抗獨特型抗體。為制備單克隆抗獨特型抗體Ab2,F(ab＇)2片段和福氏佐劑乳化后免疫小鼠。隨著免疫次數(shù)的增加，小鼠血清中抗獨特型抗體的濃度也在增加。Ab2能夠抑制Ab1與harpin的結合，當抑制率達到50％時，三只小鼠血清的稀釋倍數(shù)分別為：鼠1(917)＜鼠2(1094)＜鼠3(2540)。因此我們選取競爭抑制效果最好的小鼠3進行細胞融合。
　　 應用間接ELISA

11、法和競爭抑制ELSIA法篩選具有HarpinXoo“內(nèi)影像”特征的抗獨特型抗體。用間接ELISA法初步篩選，獲得224株抗Ab1的陽性克隆，進一步用競爭ELSIA法篩選，抑制率達到50％以上的細胞株僅獲得23株。經(jīng)過第一輪篩選，具有全部抗獨特型抗體的特征并能穩(wěn)定分泌抗體的細胞株6B2被篩選出來。競爭ELISA結果表明，6B2與Ab1的結合受harpin抑制，但不受其它無關蛋白如：BSA抑制，這進一步可以說明6B2與Ab1的結合位點可能為

12、獨特型結合位點。6B2與HarpinXoo競爭性地結合非寄主植物中推定的harpin受體，這是本研究的關鍵所在。6B2與受體的結合位點和harpin與受體的結合位點可能為同一個活性位點或非常相近的活性位點。6B2與非寄主植物中推定受體的結合可能是交叉反應的結果，或者受體構象發(fā)生改變結果，然而，也有可能是兩種機制共同作用的結果。6B2免疫新西蘭大白兔進一步誘導出與兔源多克隆抗體Ab1相同或相似活性的Ab3，這就佐證了我們制備的抗獨特型抗體

13、6B2確實具有HarpinXoo的“內(nèi)影像”特征。這些結果表明，6B2具有抗原相似性，即，抗獨特型抗體6B2可以充當HarpinXoo抗原的“內(nèi)影像”，因此，根據(jù)Jeme的系統(tǒng)命名法，6B2可以歸類為Ab2β。
　　 總之，應用抗獨特型抗體進行抗原模擬是探索生物體內(nèi)含量非常低的受體的一種可行方法。這種方法涉及到多種學科，如：蛋白質化學、酶學、免疫學以及蛋白質-蛋白質互作，其應用也是非常廣泛的，如：功能模擬，用作探針鑒定受體和免疫