利用caco-2和thp-1共培養(yǎng)模式分析卡拉膠的致炎作用【畢業(yè)設(shè)計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　利用Caco-2和THP-1共培養(yǎng)模式分析卡拉膠的致炎作用 </p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)

2、班級 生物技術(shù) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　

3、　目錄</b></p><p><b>　　中英文摘要</b></p><p><b>　　1 引言1</b></p><p>　　1.1卡拉膠的一般特性1</p><p>　　1.2卡拉膠的重要應(yīng)用1</p><p>　　1.3卡拉膠的安全情況1<

4、/p><p>　　1.4卡拉膠的研究進(jìn)展1</p><p>　　1.5 卡拉膠的研究意義2</p><p><b>　　2 材料與儀器2</b></p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料2</p><p><b>　　2.2 儀器2</b></p><p

5、><b>　　3 實(shí)驗(yàn)方法2</b></p><p>　　3.1 三種聚合度卡拉膠的制備2</p><p>　　3.1.1 Mw為1-4kDa的卡拉膠樣品的制備2</p><p>　　3.1.2 Mw<5000的卡拉膠樣品的制備3</p><p>　　3.1.3 Mw<5000的卡拉膠樣品的分子

6、量范圍確定3</p><p>　　3.2 細(xì)胞培養(yǎng)3</p><p>　　3.3 MTT法檢測細(xì)胞毒3</p><p>　　3.4 檢測卡拉膠樣品是否被LPS污染3</p><p>　　3.5 卡拉膠對結(jié)腸上皮細(xì)胞分泌IL-8的影響3</p><p>　　3.6 模型的建立方法3</p>&l

7、t;p>　　3.7 ELISA檢測卡拉膠刺激模型后細(xì)胞分泌IL-8和TNF-α的變化4</p><p>　　3.8 統(tǒng)計學(xué)處理4</p><p><b>　　4 結(jié)果4</b></p><p>　　4.1 MTT法檢測卡拉膠樣品的細(xì)胞毒活性4</p><p>　　4.2卡拉膠對結(jié)腸上皮細(xì)胞分泌IL-8的影響

8、結(jié)果5</p><p>　　4.3模型的建立情況6</p><p>　　4.4卡拉膠刺激模型后細(xì)胞分泌IL-8和TNF-α的變化及Caco-2細(xì)胞膜層完整性檢測結(jié)果7</p><p><b>　　5 討論8</b></p><p><b>　　致謝10</b></p><

9、;p><b>　　參考文獻(xiàn)11</b></p><p>　　摘要：目的： 研究卡拉膠的致炎作用方式。方法：用結(jié)腸上皮細(xì)胞Caco-2細(xì)胞與巨噬細(xì)胞THP-1細(xì)胞建立共培養(yǎng)模型，待Caco-2分化成單層膜后，用9種卡拉膠樣品在低濃度下（10μg.mL-1）作用于該模型，采用ELISA試驗(yàn)分別檢測THP-1細(xì)胞分泌TNF-α和Caco-2細(xì)胞分泌IL-8的情況，以這兩種典型的相關(guān)炎癥因子

10、的產(chǎn)生和變化情況為指標(biāo)，對卡拉膠的致炎作用機(jī)理做出評估。結(jié)果： 9種卡拉膠樣品都會影響Caco-2細(xì)胞 IL-8的分泌。在模型中，以10μg.mL-1卡拉膠樣品作用Caco-2細(xì)胞層，發(fā)現(xiàn)IL-8分泌與對照組相比有顯著的增加。其中，ι<5000刺激時細(xì)胞分泌的IL-8與對照組相比增加高達(dá)50倍。模型的下層THP-1細(xì)胞分泌的TNF-α增幅沒有IL-8顯著，其中ι<5000作用時THP-1細(xì)胞分泌的TNF-α與空白對照組相比增

11、加了3倍。同時，對Caco-2細(xì)胞層的完整性進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，卡拉膠刺激過的模型中的Caco-2細(xì)胞層被損壞，而對照組的Caco-2細(xì)胞層保持較為完整。結(jié)論：卡拉膠引起結(jié)腸上皮細(xì)胞免疫反應(yīng)沒有結(jié)構(gòu)效應(yīng)?？ɡz可能是通過刺激上皮細(xì)胞發(fā)生免疫級聯(lián)反應(yīng)，最</p><p>　　關(guān)鍵詞：卡拉膠；腸道炎癥；共培養(yǎng)；Caco-2；THP-1 </p><p>　　Abstract: Aim: The ai

12、m of this study is to explore the way of carrageenan-induced inflammatory. Method: In vitro co-cultured Caco-2 and THP-1 cells model was used to estimate gut in?ammation. 9 types of carrageenan samples at a low concentra

13、tion (10μg.mL-1) actted on the model after Caco-2 cells differentialt into monolayer, then TNF-α secretion in THP-1 cells and IL-8 secretion in Caco-2 cells was determined by ELISA, and the mechanism of inflammation indu

14、ced by carrageenan was assessed by obse</p><p>　　Keywords: Carrageenan; Gut in?ammation; Co-culture; Caco-2; THP-1</p><p><b>　　1引言</b></p><p>　　1.1 卡拉膠的一般特性</p>&

15、lt;p>　　卡拉膠（Carrageenan，又稱角叉菜膠、鹿角菜膠）是自紅藻（Red aglae, Rhodophyta）中提取的一種水溶性膠體（屬天然多糖植物膠）[1]。從結(jié)構(gòu)來說，所有的卡拉膠都是由多糖類硫酸酯鹽和3,6-脫水半乳糖直鏈聚合物所組成。因硫酸基團(tuán)和內(nèi)醚鍵位置不同，現(xiàn)已分為七種類型的卡拉膠：κ-、λ-、ι-、µ-、θ-、ξ-和ν-型[2]，其中在生產(chǎn)中最常用的是κ-、λ-和ι-卡拉膠3種類型 [3]。商

16、品卡拉膠一般為白色或淡黃色粉末，無臭、無味，粗制的產(chǎn)品稍帶海藻味?？ɡz具有良好的水溶性、粘性、膠凝性及與其他多糖或蛋白質(zhì)的協(xié)同增效作用[4]，且其形成的凝膠是熱可逆性的。所有類型的卡拉膠都能在熱水或熱牛奶中溶解；而在冷水中，只有κ-和ι-型卡拉膠的鈉鹽能溶解，其鉀鹽或鈣鹽只能吸水膨脹而不能溶解。卡拉膠在甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇和丙酮等有機(jī)溶劑中也是不能溶解的[5]。</p><p>　　1.2 卡拉膠的重要應(yīng)用

17、</p><p>　　由于卡拉膠具有獨(dú)特的生物學(xué)性質(zhì)，可以制成親水膠體、凝膠、增稠、乳化、成膜、穩(wěn)定分散劑等[6]，因此受到食品、日用化工和醫(yī)藥等行業(yè)的青睞[7]?？ɡz在食品工業(yè)中主要應(yīng)用于乳制品、肉制品、酒類和軟糖類等，主要表現(xiàn)在具凝膠、增稠和蛋白反應(yīng)性[8]三個方面：pH<5.0時，卡拉膠的凝膠強(qiáng)度隨pH的增大而增強(qiáng)[9]；卡拉膠的增稠作用可以賦予物料一定的稠度[10]，提高冰淇淋的膨脹率和融化率[1

18、1]；在蛋白質(zhì)溶液中卡拉膠吸附蛋白質(zhì)分子后，可使蛋白溶液懸浮穩(wěn)定[12]?？ɡz在日用化工行業(yè)中主要應(yīng)用于彩條牙膏、潤膚制品、洗滌劑等，以彩條牙膏為例，由于卡拉膠優(yōu)良的耐鹽性、抗酶性和非牛頓流體特征，可明顯提高膏體的觸變性并改善膏體的成型性，從而很好地減少了彩條牙膏發(fā)生串色的幾率[13]。</p><p>　　另有研究表明，卡拉膠是一類低毒的廣譜抗病毒化合物[14]。在體外，卡拉膠是人免疫缺陷病毒（HIV）、單純

19、皰疹病毒（HSV）、人巨噬細(xì)胞病毒、皰疹性口腔炎病毒、新培斯病毒等的有效抑制劑；在體內(nèi)，卡拉膠能誘導(dǎo)多形核嗜中性白細(xì)胞滲入腹膜腔，抑制從腹膜腔到血漿的病毒傳播。近年來，卡拉膠的抗病毒研究集中于抗HIV和HSV的活性。研究結(jié)果顯示，卡拉膠具有抗病毒作用，在一定條件下能抗艾滋病HIV-1活性[15]，有望成為抗HIV和HSV的藥物?？茖W(xué)家在對卡拉膠的研究中指出，飲食中適量的κ-卡拉膠可加強(qiáng)先天免疫力，并可抵抗來自溶藻弧菌的感染[16]。&l

20、t;/p><p>　　1.3 卡拉膠的安全情況</p><p>　　許多動物實(shí)驗(yàn)的研究都表明卡拉膠會對腸黏膜產(chǎn)生較嚴(yán)重的影響，會造成潰瘍和腫瘤[17]。無論是高M(jìn)w還是低Mw的λ-、κ-、ι-型的卡拉膠都會對腸上皮細(xì)胞造成有害影響。低Mw的卡拉膠比未降解的高M(jìn)w的卡拉膠有害作用更加明顯[18]。然而，較低Mw的卡拉膠（Mw<30,000）可以很容易地經(jīng)酸、熱、機(jī)械加工或細(xì)菌作用由較高M(jìn)w

21、的卡拉膠而降解得到[19]。已有研究表明用未降解的ι-型卡拉膠（Mw＜100,000）喂養(yǎng)小鼠數(shù)天后，可檢測到小鼠體內(nèi)的上皮細(xì)胞遭到了破壞，巨噬細(xì)胞中的一些炎癥因子也發(fā)生了改變[20] 。用未降解的λ-型卡拉膠（Mw在300,000）喂養(yǎng)小鼠數(shù)天，該實(shí)驗(yàn)小鼠出現(xiàn)紅斑遠(yuǎn)端結(jié)腸[21]。用未降解的κ-型卡拉膠喂養(yǎng)小鼠數(shù)天，未發(fā)現(xiàn)有致炎和潰瘍反應(yīng)[22]。目前，對于這三種卡拉膠的致炎效果的高低的研究還是空白。降解卡拉膠（Mw在20,000-3

22、0,000），喂養(yǎng)豚鼠數(shù)天，觀察到巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞都有浸潤現(xiàn)象。用降解ι-型卡拉膠（Mw＜30,000）喂養(yǎng)豚鼠數(shù)天，可明顯產(chǎn)生潰瘍[23]。降解的ι-型卡拉膠喂養(yǎng)小鼠和豚鼠數(shù)天，可以發(fā)現(xiàn)小鼠腸上皮細(xì)胞的通透性增加，出現(xiàn)了潰瘍反應(yīng)。Jo</p><p>　　1.4 卡拉膠的研究進(jìn)展</p><p>　　目前，低Mw的低聚卡拉膠（聚合度DP<20）主要涉及藥用開發(fā)[26]。這些研究的

23、方向多偏重于免疫增強(qiáng)劑、抗腫瘤等，活性研究的焦點(diǎn)集中在一些免疫因子或免疫細(xì)胞的mRNA表達(dá)的上調(diào)，其結(jié)果的評價傾向于藥用化方向[27]，但是研究中很少考慮劑量使用的安全性問題。而近有研究表明，低Mw的低聚卡拉膠可促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，以不同聚合度的卡拉膠降解物對人結(jié)腸上皮細(xì)胞的影響入手，從而便于進(jìn)一步研究其引發(fā)潰瘍的程度及原因[28]。Takeshi等人[29]，已經(jīng)利用Caco-2細(xì)胞與RAW264.7細(xì)胞建立體外共培養(yǎng)模型來

24、進(jìn)行腸道炎癥的研究，該共培養(yǎng)模型能較好地模仿體內(nèi)類似的腸道炎癥（IBD），因此該研究方法是很有意義的。目前仍有必要對卡拉膠，特別是低Mw的卡拉膠使用安全范圍的確定，也可為其作為藥物候選物的開發(fā)提供其安全性值。</p><p>　　1.5 卡拉膠的研究意義</p><p>　　本項試驗(yàn)旨在通過Caco-2和THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)模式模擬體內(nèi)腸道環(huán)境，待該體外共培養(yǎng)模型建成后，用準(zhǔn)備好的9種卡拉

25、膠樣品在低濃度下（10μg.mL-1）分別作用于該模型。利用ELISA試驗(yàn)（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）定量檢測模型下層THP-1細(xì)胞分泌TNF-α因子的能力和模型上層Caco-2細(xì)胞分泌IL-8因子的能力，以兩種典型的相關(guān)炎癥因子——腫瘤壞死因子（TNF-α）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）的產(chǎn)生和變化情況為指標(biāo)，并結(jié)合Caco-2細(xì)胞層完整性的破壞情況，綜合分析卡拉膠的致炎方式，對卡拉膠的致炎作用機(jī)理做出評估。這一研究的結(jié)果闡明了卡拉膠的非安全性

26、來源，推動了卡拉膠在食品添加劑行業(yè)的重新定位，也給海藻寡糖或多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供了可開拓的空間和安全性的指導(dǎo)。此研究領(lǐng)域?qū)⒊蔀槟壳皣H上關(guān)于卡拉膠的致炎模型使用、食品安全評價和海洋藻類多糖應(yīng)用前景的焦點(diǎn)。</p><p><b>　　2材料與儀器</b></p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p&

27、gt;　　Caco-2和THP-1細(xì)胞（購于ATTC公司）；RPMI1640培養(yǎng)基和MEM培養(yǎng)基購于Gibco BRL（Grand Island,NY,USA）；κ-、λ-和ι-型卡拉膠購于Sigma（St.Louis,MO,USA）；Sephadex G-25、Sephadex G-10和ELISA試劑盒（購于武漢博士德生物工程有限公司）；胰酶細(xì)胞消化液和蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（購于碧云天生物技術(shù)研究所）；類標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清 FBS

28、（購于蘭州民海生物工程有限公司）；Millicell（購于millionpore公司）。</p><p><b>　　2.2 儀器</b></p><p>　　R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申順生物科技有限公司）；BSZ-100自動部分收集器（上海青浦滬西儀器廠）；HL-2恒流泵（上海青浦滬西儀器廠）；W201D恒溫水浴鍋（上海申順生物科技有限公司）；恒速攪拌器（上海申順

29、生物科技有限公司）；電子式可調(diào)電爐（南通金石實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；Multikem MK3酶標(biāo)儀（ThermoLabsystem公司）；大型冷凍離心機(jī)和CO2培養(yǎng)箱（杭州達(dá)科科學(xué)儀器有限公司）；凍干機(jī)（SIM USA Intl. Group）；流式細(xì)胞儀；倒置顯微鏡；超凈工作臺；高壓蒸汽滅菌鍋。</p><p><b>　　3實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　3.1

30、 三種聚合度卡拉膠的制備 </p><p>　　本研究共包括9個樣品：κ原、ι原、λ原（表示未經(jīng)任何處理的κ-、ι-、λ-卡拉膠）；κ1-4kDa、ι1-4kDa、λ1-4kDa（表示分子量范圍在1-4kDa的卡拉膠降解樣品）；κ<5000、ι<5000、λ<5000（表示分子量小于5000的卡拉膠降解樣品）。實(shí)驗(yàn)中采用酸降解[30,31]的方法降解卡拉膠，采用超濾的方法進(jìn)行分離。</p&

31、gt;<p>　　3.1.1 Mw為1-4kDa的卡拉膠樣品的制備</p><p>　　稱取κ-、ι-和λ-卡拉膠各0.5g分別用50mL雙蒸水配制成1%溶液，煮沸溶化。用1mol.L-1的HCl調(diào)pH至1.9，37℃攪拌反應(yīng)4h，用1 mol.L-1的NaOH中和至pH為7。用截留Mw為50,000的超濾離心管離心，收集Mw<50000的組分，再用截留Mw為10,000的超濾離心管離心，收集

32、Mw>10000的組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并冷凍干燥,得到1-4 KDa的卡拉膠樣品。</p><p>　　3.1.2 Mw<5000的卡拉膠樣品的制備</p><p>　　稱取κ-、ι-和λ-卡拉膠各0.5g分別用50mL雙蒸水配制成1%溶液，煮沸溶化。用0.1mol.L-1的HCl，60℃攪拌分別反應(yīng)5h、3.5h、2h（根據(jù)不同類型的卡拉膠反應(yīng)不同的時間），中和。用截留Mw為5

33、000的超濾離心管離心，收集Mw<5000的寡糖組分，然后濃縮并用Sephadex-G10脫鹽，濃縮并凍干。</p><p>　　3.1.3 Mw<5000的卡拉膠樣品的分子量范圍確定</p><p>　　將脫鹽后的物質(zhì)加入到Sephadex G-25的凝膠柱中進(jìn)行分離純化，流速為50mL.h-1,自動收集器收集。用以葡聚糖三糖和Mw為5000的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖上Sephadex G

34、-25凝膠柱，苯酚-硫酸法檢測，492nm下測吸光值，得洗脫曲線。再將降解得到的粗樣品上Sephadex G-25凝膠柱。將其與標(biāo)準(zhǔn)糖的出峰時間相比較來確定是否是所需要的Mw<5000卡拉膠樣品。 </p><p><b>　　3.2 細(xì)胞培養(yǎng)</b></p><p>　　Caco-2細(xì)胞和THP-1細(xì)胞均購于武漢典型培養(yǎng)物保藏中心。于5%CO2，37℃的條件下

35、,用含10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1細(xì)胞。</p><p>　　3.3 MMT法檢測細(xì)胞毒</p><p>　　采用MTT法測定細(xì)胞毒，4-5×104細(xì)胞/孔的Caco-2細(xì)胞加入96孔板中，置于37?C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。加入終濃度5μg.mL-1、10μg.mL-1和15μg.mL-

36、1卡拉膠樣品，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入20µl 5 mg.mL-1的 MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄培養(yǎng)液，每孔加入150µL 二甲基亞砜（DMSO）溶解MTT，并于492nm處測定各孔的光吸收值（OD），通過公式1計算細(xì)胞的存活率（Survival Rate）。</p><p>　　SR＝OD樣品/OD陰性對照×100 % （公式1）</p><p&g

37、t;　　3.4 檢測卡拉膠樣品是否被LPS污染</p><p>　　多粘菌素B（Polymyxin B，PMB）可以直接中和LPS，使其喪失引起炎癥反應(yīng)的功能。國際上普遍使用PMB作為LPS的抑制劑。有報道中指出卡拉膠很容易被LPS污染[32]，因此，用卡拉膠（20μg.mL-1)和LPS（1μg.mL-1)刺激Caco-2細(xì)胞24h，同時加入和不加PMB，檢測CGN是否被LPS污染。用ELISA檢測細(xì)胞分泌IL

38、-8的變化情況。</p><p>　　3.5 卡拉膠對結(jié)腸上皮細(xì)胞分泌IL-8的影響</p><p>　　利用ELISA檢測卡拉膠對結(jié)腸上皮細(xì)胞Caco-2分泌IL-8的影響。加藥前換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，隨后卡拉膠10μg.mL-1作用細(xì)胞24h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，具體操作方法參照ELISA試劑盒要求操作。</p><p>　　3.6 模型的建立方法</p

39、><p>　　先將millicell的小室（如圖1所示）轉(zhuǎn)移到含有600mL.孔-1的24孔培養(yǎng)板中在37?C，5%CO2培養(yǎng)箱中平衡過夜，之后將Caco-2 細(xì)胞以3.75×105細(xì)胞.孔-1（約400μL.孔-1）的密度接種到小室中培養(yǎng)>15d，在此期間每隔3d更換培養(yǎng)基。HE染色監(jiān)測Caco-2細(xì)胞呈膜的完整性。</p><p>　　取處于指數(shù)生長期的THP-1細(xì)胞懸液，

40、調(diào)節(jié)密度為106 細(xì)胞.mL-1，接種于24孔板中，每孔1mL，立即加入PMA（終濃度為0.1μg.mL-1）誘導(dǎo)36h，促使其分化為巨噬細(xì)胞；用PBS洗三次，換無血清RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12h，將已經(jīng)形成完整細(xì)胞膜層的小室轉(zhuǎn)移到此板中，模型建立完成的模擬如圖2所示。</p><p>　　圖1. 培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞用的millicell小室</p><p>　　Figure

41、1. Caco-2 cells were cultured in the millicell</p><p>　　圖2. 由Caco-2細(xì)胞與THP-1細(xì)胞構(gòu)成的共培養(yǎng)模型。上層含有Caco-2細(xì)胞的millicell小室插入到下層培養(yǎng)THP-1細(xì)胞的24孔板內(nèi)。</p><p>　　Figure 2. Co-cultured model by Caco-2 and THP-1 cells

42、, cultured in The millicell which culture Caco-2 cells (apical side) were chambered into 24 well plate which culture THP-1 cells (basolateral side).</p><p>　　3.7 ELISA檢測卡拉膠刺激模型后細(xì)胞分泌IL-8和TNF-α的變化</p>&

43、lt;p>　　用準(zhǔn)備好的9種卡拉膠樣品在低濃度下（10μg.mL-1）處理該共培養(yǎng)模型，同時設(shè)置空白對照組（上、下層均有細(xì)胞但不加藥處理）和陰性對照組（僅上層有細(xì)胞加藥處理），再置于CO2 培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。取該共培養(yǎng)模型各孔上、下層的上清，再用ELISA試劑盒檢測THP-1細(xì)胞分泌TNF-α 因子的能力和Caco-2細(xì)胞分泌IL-8因子的能力。</p><p><b>　　3.8 統(tǒng)計學(xué)處理

44、</b></p><p>　　以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)做3次，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較用t檢驗(yàn)，以P<0.05為顯著差異。</p><p><b>　　4 結(jié)果</b></p><p>　　4.1 MTT法檢測卡拉膠樣品的細(xì)胞毒活性</p><p>　　對9種樣品的細(xì)胞毒性

45、進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這9種卡拉膠樣品的細(xì)胞毒活性在5-15μg.mL-1濃度范圍內(nèi)活性很低。當(dāng)濃度為15μg.mL-1時，λ原、κ原、ι原、λ1-4 kDa、κ1-4 kDa、ι1-4 kDa、λ<5000、κ<5000、ι<5000作用細(xì)胞存活率分別為（88.25±9.09）%、（89.19±5.78）%、（94.37±7.24）%、（87.16±11.98）%、（90.93&

46、#177;15.17）%、（91.73±8.67）%、（94.51±9.17）%、（96.11±11.12）%和（102.41±6.12）%（結(jié)果如表1所示）。接下來，研究卡拉膠的致炎作用的藥物濃度在此范圍以內(nèi)是否會直接對細(xì)胞產(chǎn)生損壞。</p><p>　　表1. 不同濃度下卡拉膠的細(xì)胞毒活性</p><p>　　Table1. under diff

47、erent concentrations of carrageenans cytotoxic</p><p>　　4.2卡拉膠對結(jié)腸上皮細(xì)胞分泌IL-8的影響結(jié)果</p><p>　　通過“方法”3.4和3.5的實(shí)驗(yàn)檢測，確定是卡拉膠沒有被LPS污染（數(shù)據(jù)略）。隨后我們用9種卡拉膠樣品在低濃度下（10μg.mL-1）處理陰性對照組的結(jié)腸上皮細(xì)胞Caco-2 24h ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這9種卡拉膠

48、都會影響Caco-2 細(xì)胞IL-8的分泌，表明卡拉膠引起炎癥反應(yīng)沒有結(jié)構(gòu)效應(yīng)。其中，ι1-4kDa作用后Caco-2分泌的IL-8與空白組相比增加了約1.8倍（結(jié)果如圖3所示）。從結(jié)果可知，10μg.mL-1濃度的卡拉膠對Caco-2分泌IL-8的影響是有限的，沒有使細(xì)胞分泌的IL-8顯著增加。</p><p>　　圖3. 不同卡拉膠對Caco-2分泌IL-8的影響</p><p>　　F

49、igure 3. Different carrageenan on Caco-2 secretion of IL-8</p><p>　　4.3模型的建立情況</p><p>　　腸上皮細(xì)胞之間有一種特殊的緊密連接，是相鄰上皮細(xì)胞間隙的松散連接，由多種功能各異的蛋白組成，該結(jié)構(gòu)可以有效的阻止腸腔內(nèi)細(xì)菌、毒素及炎性介質(zhì)等物質(zhì)的旁細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng)腸上皮細(xì)胞之間相互連接形成緊密連接的生物屏障后，便可

50、以有效發(fā)揮防御功能。在體外模擬腸上皮細(xì)胞屏障，即是建立一層緊密連接的細(xì)胞層。Caco-2作為結(jié)腸上皮細(xì)胞，具有生長成為緊密連接的細(xì)胞層的能力。以半透膜作為基底，Caco-2細(xì)胞附著生長，隨機(jī)抽查細(xì)胞層完整性情況。到Caco-2細(xì)胞生長到10d時，細(xì)胞層覆蓋率達(dá)到70%（如圖4-A、5-A所示），生長到15d后，細(xì)胞層覆蓋率為90%以上（如圖4-B所示），生長到20d之后細(xì)胞層完全覆蓋基底質(zhì)形成完整腸上皮細(xì)胞屏障（如圖5-B所示）。此時細(xì)

51、胞層具有一定的屏障功能，保護(hù)下層物質(zhì)阻擋外界刺激的作用。將已呈膜的Caco-2細(xì)胞的小室轉(zhuǎn)移到具有THP-1細(xì)胞的孔板中，模型即建立成功，可以用于模擬卡拉膠刺激腸上皮細(xì)胞之后引起一系列細(xì)胞免疫響應(yīng)的情況。</p><p>　　圖4. HE染色監(jiān)測Caco-2細(xì)胞在Millicell 小室中的呈膜情況（A，Caco-2細(xì)胞在小室上培養(yǎng)10d已經(jīng)覆蓋70%； B，Caco-2細(xì)胞在小室上培養(yǎng)15d已經(jīng)覆蓋90%以上）

52、</p><p>　　Figure 4. To monitor the case of Caco-2 cells presenting chamber in Millicell by HE staining (A, the chamber of Caco-2 cells in the small room has already covered 70% on the train 10d; B, the chamb

53、er of Caco-2 cells in the small room has been covered 90% on the train 15d)</p><p>　　圖5. 顯微觀察 HE染色監(jiān)測Caco-2細(xì)胞在Millicell 小室中的呈膜情況（A，Caco-2細(xì)胞在小室上培養(yǎng)10d沒有完全覆蓋基底膜； B，Caco-2細(xì)胞在小室上培養(yǎng)20d 已經(jīng)完全覆蓋基底膜）</p><p&g

54、t;　　Figure 5. To monitor the case of Caco-2 cells stained by HE presenting chamber in Millicell by Microscope ( A, Caco-2 cells cultured in a small room on the 10d did not fully cover the basement membrane; B, Caco-2 ce

55、lls cultured in a small room on the 20d have completely covered the basement membrane)</p><p>　　4.4 卡拉膠刺激模型后細(xì)胞分泌IL-8和TNF-α的變化及Caco-2細(xì)胞膜層完整性檢測結(jié)果</p><p>　　低濃度的卡拉膠的細(xì)胞毒活性很低，不會對Caco-2細(xì)胞產(chǎn)生直接的損傷。當(dāng)以濃度為1

56、0μg.mL-1的卡拉膠樣品直接刺激Caco-2細(xì)胞（即陰性對照組）時，細(xì)胞分泌的IL-8改變不顯著。但是，在模型中，以相同濃度10μg.mL-1的卡拉膠樣品作用Caco-2細(xì)胞層后，發(fā)現(xiàn)IL-8分泌與對照組相比有顯著的增加（結(jié)果如圖6所示）。其中，當(dāng)用ι<5000刺激時細(xì)胞分泌的IL-8與對照組相比增加高達(dá)50倍。模型中下層的THP-1細(xì)胞分泌的TNF-α增幅沒有IL-8顯著，其中ι<5000作用時THP-1細(xì)胞分泌的TN

57、F-α與空白對照組相比增加了3倍（結(jié)果如圖7所示）。同時，我們對Caco-2細(xì)胞層的完整性進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，卡拉膠刺激過的模型中的Caco-2細(xì)胞層被損壞，而對照組的Caco-2細(xì)胞層保持較為完整（如圖8所示）。</p><p>　　圖6. 不同卡拉膠（10 μg.mL-1）刺激模型后對Caco-2細(xì)胞分泌IL-8的影響</p><p>　　Figure 6. IL-8 secretion i

58、n Caco-2 cells after different carrageenan (10μg.mL-1) stimulation the model</p><p>　　圖7. 不同卡拉膠（10 μg.mL-1）刺激模型后對THP-1細(xì)胞分泌TNF-α的影響</p><p>　　Figure7. TNF-α secretion in THP-1 cells after differen

59、t carrageenan (10μg.mL-1) stimulation the model</p><p>　　圖8. 不同卡拉膠（10 μg.mL-1）刺激模型后對Caco-2細(xì)胞層的損壞（A，卡拉膠刺激模型實(shí)驗(yàn)組； B，實(shí)驗(yàn)組模型小室上Caco-2細(xì)胞層被嚴(yán)重?fù)p壞； C，空白對照組卡拉膠刺激后Caco-2細(xì)胞層較為完整）</p><p>　　Figure 8. The case o

60、f Caco-2 cell layer damaged after different carrageenan (10 μg.mL-1) stimulation the model( A,the experimental group model of carrageenan stimulation; B, the Caco-2 cell layer was severely damaged in the small room of t

61、he experimental group model; C, the Caco-2 cell of blank control maintain relatively complete after carrageenan stimulation)</p><p><b>　　5討論</b></p><p>　　卡拉膠具有多方面的活性，在藥理學(xué)研究中被用作炎癥模型的

62、工具藥。有較多的試驗(yàn)已經(jīng)證明，動物長期口服降解或未降解的卡拉膠可引起腸黏膜損傷、潰瘍性結(jié)腸炎和導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，這些不良后果是相當(dāng)嚴(yán)重的。由于卡拉膠目前仍然作為增稠劑和穩(wěn)定劑在食品中應(yīng)用極為廣泛,如用于奶制品、布丁、沙拉醬、果汁等，尤其是它們常常是兒童的主要食品，因此其安全性必須引起足夠的重視。</p><p>　　腸粘膜上皮細(xì)胞是組成腸道生物屏障的主要成員，它與粘膜上皮下方的結(jié)締組織和固有層的支持組織，以及固有層中

63、含有成纖維細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等，共同組成屏障功能單位。本實(shí)驗(yàn)以結(jié)腸上皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞構(gòu)建共培養(yǎng)模型研究卡拉膠致炎作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低濃度下（10μg.mL-1）卡拉膠對結(jié)腸上皮細(xì)胞Caco-2的細(xì)胞毒活性很低，單刺激結(jié)腸上皮細(xì)胞時對其IL-8分泌的影響不顯著。但是，當(dāng)以同樣的濃度10μg.mL-1卡拉膠作用于Caco-2與THP-1的共培養(yǎng)模型時，Caco-2細(xì)胞分泌的IL-8有顯著的增加，從幾

64、倍增到幾十倍，THP-1細(xì)胞分泌的TNF-α也有明顯的增加。同時，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)用卡拉膠處理共培養(yǎng)模型后，模擬腸上皮屏障的Caco-2細(xì)胞層被損壞，而對照組細(xì)胞層則較為完整。引起相應(yīng)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的機(jī)理推測：當(dāng)卡拉膠刺激上層Caco-2細(xì)胞后，導(dǎo)致IL-8分泌增加，IL-8被轉(zhuǎn)運(yùn)到下層，刺激THP-1產(chǎn)生TNF-α，TNF-α可以促使上層的Caco-2細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而造成了Caco-2細(xì)胞層的破壞，同時又再次刺激Caco-2使細(xì)胞分泌IL-8進(jìn)

65、一步的增加，從而引</p><p>　　民以食為天，食以安為先。近幾年對于食品安全性的問題人們是越來越重視了，從三鹿奶粉到染色饅頭，嚴(yán)重危害到人類的健康?？ɡz作為常用的食品添加劑，且具有致炎作用及能引發(fā)腸道炎癥疾病的潛在危險性，其使用安全性的評估需要得到重視，希望有關(guān)部門對卡拉膠使用的安全性進(jìn)行重新評估。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p&g

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