酶免疫分析技術在生物藥物分析中的應用

1、第四節(jié) 酶免疫分析技術在生物藥物分析中的應用,其應用主要包括以下幾個方面：藥物含量（活性）測定宿主蛋白殘留檢測抗生素殘留檢測雜質檢測污染物檢測藥物原材料檢測藥物摻假檢測,一、GLP-1活性檢測,Cyclic Adenosine Monophosphate (cAMP) ELISA Kit,GLP-1,GLP-1是已發(fā)現(xiàn)的促胰島素分泌作用最強的腸肽類激素，它通過與GLP-1受體(GLP-1R)結合發(fā)揮作用 1）G

2、LP-1可通過刺激胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌及胃排空來降低血糖 2）GLP-1還有減緩β細胞凋亡，促進其再生的獨特作用 3）GLP-1還能減慢胃排空速度，通過作用下丘腦，抑制食欲。,GLP-1結合GLP-1R后，激活細胞膜內環(huán)腺苷酸(cAMP)和絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路胰島成熟β細胞的GLP-1受體偶聯(lián)Gs，活化腺苷酰環(huán)化酶，產生cAMP，后者與葡萄糖協(xié)同刺激胰島素合成和分泌，刺激胰島素基因轉錄和

3、胰島素原生物合成，可降低胰高血糖素濃度并抑制胰高血糖素分泌，增強細胞對胰島素的敏感性，刺激胰島素依賴性糖原合成，降低餐后血糖濃度。,報告基因檢測原理,試驗原理,采用直接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被cAMP特異性抗體，樣品中cAMP將和標準HRP-cAMP競爭結合微孔條上cAMP特異性抗體，用TMB底物顯色，吸光值與樣品中cAMP的含量成負相關。以吸光值為縱坐標，樣品濃度為橫坐標，按四參數(shù)法回歸擬合對照品和供試品的量效曲線

4、，得出半效量濃度，求得供試品相對生物活性。,操作程序：,1、取微孔板條，加入cAMP特異性抗體，50ul/孔，室溫1 h;2、洗滌后，向不同孔中分別cAMP、對照或細胞裂解上清品（樣品），100ul/孔；3、向孔中加入HRP-cAMP，50 ul/孔，室溫作用2h；4、洗滌后，向孔中加入TMB溶液， 200 ul/孔，室溫作用30min；5、向孔中加入終止液，100 ul/孔，測定OD450nm/570nm,數(shù)據與結果,1. 標

5、準曲線的繪制：（1）測定各濃度梯度下各孔對照品和供試品相應的吸光值，并分別計算平均值；（2）以吸光值為縱坐標，樣品濃度為橫坐標，按四參數(shù)法回歸擬合對照品和供試品的量效曲線，得出半效量濃度；對照品EC50；測試樣EC502. 數(shù)據處理： 供試品相對生物活性（%）=對照品EC50/供試品EC50?100% 其中：對照品和供試品的EC50分別表示對照品和測試樣的半效量的濃度。四參數(shù)方程中的C值即相當于半效量的濃度(EC50)。

6、,典型的測定結果及回歸曲線,二、宿主蛋白（HCP）殘留檢測,Cygnus  F550 CHO HCP ELISA Kit,宿主細胞蛋白污染物,CHO宿主蛋白殘留  E-coli宿主蛋白殘留  酵母菌宿主蛋白殘留  HEK293宿主蛋白殘留,2D分離CHO、酵母、大腸桿菌等細胞系的全蛋白譜將2D Gel上的全蛋白轉移至膜上，用多克隆抗體孵育后

7、進行Western Blot化學發(fā)光檢測，以確認多克隆抗體能夠與哪些宿主細胞蛋白結合通過Western Blot檢測結果（多抗能檢測到的HCP數(shù)量）與2D膜上檢測結果（總HCP數(shù)量）的比較，得出用于評價檢測的多克隆抗體特異性及適用性的Match Rate,評估HCP定量用多克隆抗體的特異性,試驗原理,采用雙位點酶聯(lián)免疫檢測法，在酶標板微孔條上預包被抗CHO CHP多抗，免疫反應構成為夾層式結構：固相抗體-HCP-酶標記抗體。反應結束后

8、清洗酶標板去除未結合反應物，添加TMB底物顯色，吸光值與樣品中CHO宿主蛋白的含量成正相關。,檢測步驟：,（1）于每個反應孔中，加入100 μL抗CHO HCP多抗-HRP；（2）從標準蛋白液、對照和樣品中吸取50 μL 上清加入到已標記好的反應孔中；180rpm下室溫、振蕩培養(yǎng)2h；（3）棄去孔內溶液，每孔加350 μL 洗滌液，重復洗滌4次；（4） 于每個反應孔中，加入100 μL TMB底物溶液，于室溫孵育30mi

9、n；（5 ）于每個反應孔中，加入100 μL終止液；依序讀取OD450/650 nm吸收值(空白對照孔調零)。（6）數(shù)據處理：根據測定每孔標準液吸光值繪制四參數(shù)邏輯曲線，然后根據樣品吸光值計算出樣品中HCP濃度。,ELISA法研究藥物作用靶點（GPⅡb/Ⅲa受體）,實驗原理根據ELISA實驗原理，先在96孔板上包被纖維蛋白原，然后同時加入GPIIb/IIIa受體和待測樣品，再加酶標抗體與GPIIb/IIIa受體結合，最后

10、加入底物，酶作用于底物顯色，在405nm測得OD值，OD值與GPIIb/IIIa受體量成正比。如果樣品與GPIIb/IIIa 受體結合，就會降低纖維蛋白原與受體的結合，導致所測的OD值降低。,實驗步驟： 首先將纖維蛋白原（10 μg/ml）用buffer A（0.1 M Na2CO3, PH 9.5）包被于96孔板上（100 μl/well）（空白對照: 不包被纖維蛋白原），4°C孵育過夜；TACTS（0.02M Tris

11、- HCl, PH 7.5，0.15M NaCl，1mM CaCl2,0.02% NaN3,0.05% Tween 20）沖洗一次，每孔200μl，3min；用含1% BSA 的TACTS 在37°C封閉1h（200 μl/well）,TACTS洗三次；整合素αIIbβ3（20 μg/ml、50 μL/well）加一定濃度的待測樣品50 μl作為樣品組；加孵育液做陰性對照組；37°C下孵育2h；TACTS 洗三次

12、；加一抗（鼠抗人CD61抗體，含0.5%BSA ,TACTS稀釋，1:2000(體積比)，100μL /孔）37°C下孵育1h；,,TACTS 洗三次；加二抗（堿性磷酸酶標記的山羊抗鼠IgG，含0.5%BSA ,TACTS稀釋，1:1000，100μL /孔），37°C下孵育1h；TACTS洗三次，加底物（對硝基苯磷酸二鈉溶液(PNPP)1mg/ml，用buffer B溶解，200μL/well），37℃下孵育30

13、min；加入50μL 3M NaOH(稱0.6g加5ml蒸餾水)終止反應；5min內405nm波長下檢測吸光度。,,數(shù)據處理通過以下公式計算抑制率：[(X?Y)/(X-Z)]×100%。X代表生理鹽水組OD值；Y代表樣品組OD值；Z代表空白對照組OD值。實驗結果都用均數(shù)±標準差（ ±s）表示，采用t檢驗進行單因素方差分析。p<0.05界定為具有統(tǒng)計學意義，所有數(shù)據處理均使用GraphPad Pris

14、m 6軟件(GraphPad Software，美國)。,溶液配制及注意事項（60 well大概用量）1. buffer A：0.1M Na2CO3 50ml：取固體0.53g溶液50ml蒸餾水中，調PH 9.5.2. TACTS洗脫液（需300ml）：定容100ml，pH 7.5， Tris-HCl：0.2423g；NaCl：0.8766g；NaN3：200μL；Tween 20:50μL；CaCl2:0.0222g。孵育液（5

15、0ml）：TACTS加0.5%BSA封閉液（20ml）：TACTS加1%BSA3. 受體αⅡbβ3（4ml）：配制1.63mg/ml母液,受體使用的終濃度為20μg/ml。4. 一抗（8ml）：1:2000；二抗（8ml）：1:10005. 樣品配制：不溶的樣品加DMSO全溶，終濃度不超0.5%6. 受體，抗體，樣品均用孵育液稀釋。,,7. buffer B（底物緩沖液）：定容100ml，PH 9.5, 二乙醇胺：105μl

16、；MgCl2：10.175mg8. PNPP對光敏感，現(xiàn)配現(xiàn)用，用buffer B溶解9. 配制的纖維蛋白原濃度越高儲存越穩(wěn)定，37℃水浴鍋加熱包被液溶解，儲存Fg>1mg/ml時較穩(wěn)定。,三、卡那霉素殘留檢測,卡那霉素檢測試劑盒,2015年版藥典凡例十六：（3）生產過程中，應盡可能避免使用抗生素，必須使用時，應選擇安全性風險相對較低抗生素，使用抗生素種類不得超過1種，且產品后繼工藝應保證可有效去除制品中抗生素，去除工藝應該驗

17、證。（4）生產過程中使用抗生素時，成品鑒定中應檢測抗生素殘留量，并規(guī)定殘留量限制。上述的生產過程包括種子培養(yǎng)活化，發(fā)酵，純化等所有的步驟，所以種子活化階段是算在生產過程中的。,試驗原理,采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中殘留的卡那霉素將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗卡那霉素抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與殘留物卡那霉素的含量成負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數(shù)，即可得出樣

18、品中卡那霉素的含量。,操作步驟,1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20-25℃)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。3、洗滌工作液在使用前也需回溫。4、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。,5、加標準品/樣本：加入標準品/樣本20ml 到對應的微孔中，加入酶標二抗50ml/孔，再

19、加入抗體工作液80ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應40min。6、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液250ml/孔，充分洗滌4－5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干。7、顯色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中避光反應15min。8、測定：加入終止液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/

20、630nm檢測，在5min內讀完數(shù)據），測定每孔OD值。,定量分析,（1）百分吸光率的計算 標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即 百分吸光度值（%）＝B/B0×100% B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0—0ppb標準溶液的平均吸光度值（2）標準曲線的繪制與計算

21、 以標準品百分吸光率為縱坐標，以卡那霉素標準品濃度（ppb）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中卡那霉素實際殘留量。,卡那霉素測定方法驗證,檢測方法和標準曲線,,競爭ELISA法測定藥盒卡那霉素標準品,卡那霉素在樣品溶液中的回收率,卡那霉素在樣品稀釋液中的回收率(n=6),精密度試驗,卡那霉素稀釋樣本競爭ELISA法分析精

22、密度試驗結果(n=6),四、人胰島素原殘留檢測,Mercodia Proinsulin ELISA kit,目前重組人胰島素生產主要以E.coli表達人胰島素原，初步純化后變復性，經胰蛋白酶(trypsin)和羧肽酶B(carboxypeptidase B)協(xié)同酶切，去掉前導肽和C-肽，形成有活性的胰島素，并進一步純化精制而成。上述工藝制備所得人胰島素產品中可能殘留人胰島素原、C-肽等人胰島素相關雜質，其殘留的存在可能影響人胰島素的

23、藥效。,Insulin conversion formation process and structure diagram,試驗原理,采用雙單抗夾心ELISA法，在酶標板微孔條上預包被抗胰島素原C-肽特異性抗體，樣品中胰島素原結合微孔條上的特異性抗體，然后加入HRP標記的抗胰島素特異性抗體，用TMB底物顯色，吸光值與樣品中胰島素原的含量成正相關。,操作步驟,1、加樣：加待檢樣品，100 μl/孔，37℃ 2 h，同上洗滌；2、加酶標

24、抗體：酶標抗體稀釋液稀釋HRP-13A4至工作濃度，100 μl/孔，37℃ 1h，同上洗滌；3、顯色和中止反應：加新鮮配制的底物100μl/孔，37℃避光作用20 min；加中止液50μl/孔終止反應，測定每孔OD450/630nm值。4、數(shù)據處理：以標準品濃度的對數(shù)log(c)對吸光值 log(y)回歸，可求得樣品中人胰島素原的殘留量。,,Standard curve for rhPI in PBS was determined