土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)-上課用

1、課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù),一、課題背景,1、尿素的利用,尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、細(xì)菌利用尿素的原因,土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕?3、常見的分解尿素的微生物,芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌。,4、課題目的,①?gòu)耐寥乐蟹蛛x出能夠分解尿素的細(xì)菌,②統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)

2、菌 (計(jì)數(shù)),一.研究思路,㈠.篩選菌株,㈡.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,㈢.設(shè)置對(duì)照,1、實(shí)例：,啟示：尋找目的菌種時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的 要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。,原因：因?yàn)闊崛獪囟?0～800C，淘汰了絕大多 數(shù)微生物只有Taq細(xì)菌被篩選出來(lái)。,DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一

3、種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。,㈠.篩選菌株,總之：要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營(yíng)養(yǎng)、生理、生長(zhǎng)條件等；配置合適的培養(yǎng)基 方法： ⑴抑制大多數(shù)微生物生長(zhǎng) ⑵造成有利于該菌生長(zhǎng)的環(huán)境， 結(jié)果：培養(yǎng)一定時(shí)間后，該菌數(shù)量上升，再通過 稀釋涂布平板法等方法對(duì)它進(jìn)行純化培養(yǎng)分離。,2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：,人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的

4、條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。,3、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：,①?gòu)奈锢硇再|(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？從功能上屬于哪類培養(yǎng)基？,固體培養(yǎng)基,②在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,選擇培養(yǎng)基,尿素是培養(yǎng)基中的唯一氮源， 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源，才能生長(zhǎng)。 缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長(zhǎng)發(fā)育繁殖

5、，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。,5、該培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理,選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。,6、怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？,以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,是,分離能分解尿素的細(xì)菌,判斷該培養(yǎng)基有無(wú)選擇性,只生長(zhǎng)能分解尿素的細(xì)菌,生長(zhǎng)多種微生物,是,欄目鏈接,用來(lái)判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用需要

6、設(shè)置的對(duì)照是( )A．未接種的選擇培養(yǎng)基B．未接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基C．接種了的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基D．接種了的選擇培養(yǎng)基,C,1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：,利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。,㈡.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：,不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；,缺點(diǎn),2.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）⑴原理：在稀釋度足夠高時(shí)，微生物在固體培養(yǎng)基上所

7、形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的，即一個(gè)菌落代表原先的一個(gè)單細(xì)胞。⑵常用方法：稀釋涂布平板法。,每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。,如何從平板上的菌落數(shù)推測(cè)出每克樣品中的菌落數(shù)？,統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計(jì)3個(gè)平板，計(jì)算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按課本旁欄的公式進(jìn)行計(jì)算,教材P22,

8、實(shí)例分析P22,第一同學(xué)只涂布了一個(gè)平板，沒有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果不具有說(shuō)服力。 第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組的問題，涂布了三個(gè)平板，但是其中1個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與2個(gè)相差太遠(yuǎn)，說(shuō)明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤，因此，不能簡(jiǎn)單地將3個(gè)平板的計(jì)數(shù)值用來(lái)求平均值。,注意事項(xiàng)①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。②為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落

9、平均數(shù)。(即設(shè)置重復(fù)組求平均數(shù))③統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。,微生物的計(jì)數(shù)法,,顯微鏡直接計(jì)數(shù)、間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）、比濁法、濾膜法,設(shè)置對(duì)照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。,㈢.設(shè)置對(duì)照：,,設(shè)置對(duì)照的方法：,①空白對(duì)照：不給對(duì)照組任何處理因素。,②條件對(duì)照（標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照）：指給予對(duì)照組一種被證明有效因素的處理,③自身對(duì)照：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組都在同一研究對(duì)象上進(jìn)行。,④相互對(duì)

10、照：不單設(shè)對(duì)照組，而是幾個(gè)實(shí)驗(yàn)組相互對(duì)照。,課P23實(shí)例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)從對(duì)應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個(gè)菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個(gè)菌落。分析其原因。,原因: (1)培養(yǎng)基被雜菌污染或操作失誤 (或者是混入了其他的含氮物質(zhì)) (2)土壤不同,小結(jié)：通過這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說(shuō)服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。,方案

11、二：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn),方案一：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,結(jié)果預(yù)測(cè)：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無(wú)誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。,將細(xì)菌放在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，它會(huì)繁殖并形成菌落(如下圖)。某實(shí)驗(yàn)小組想檢驗(yàn)兩種抗生素的殺菌作用，下列哪個(gè)實(shí)驗(yàn)方案最合適(　　),C,④菌落計(jì)數(shù),②系列稀釋,③涂布平板與培養(yǎng),①配制土壤溶液,根

12、據(jù)圖示2－7填寫以下實(shí)驗(yàn)流程：,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：,（一）土壤取樣,（二）制備培養(yǎng)基,（三）土壤樣品的稀釋,（四）取樣涂布,（五）微生物的培養(yǎng)與觀察,（八）鑒定,（七）細(xì)菌的計(jì)數(shù),二.實(shí)驗(yàn)的操作流程,二.實(shí)驗(yàn)的具體操作 ㈠.土壤取樣 從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。◆取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。,（二）制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。牛肉

13、膏蛋白胨培養(yǎng)基（作對(duì)照）,◆應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行,◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度,[三]土壤樣品的稀釋,◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度,原因：不同微生物在土壤中含量不同,由于初次實(shí)驗(yàn)，對(duì)于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個(gè)較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103～107。,由于初次實(shí)驗(yàn)，對(duì)于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個(gè)較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103～107。每個(gè)稀釋度下需要

14、3個(gè)選擇培養(yǎng)基，1個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，因此共需要15個(gè)選擇培養(yǎng)基，5個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。此外，還需要準(zhǔn)備8個(gè)滅菌的試管和1個(gè)滅菌的移液管。,為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？,原因：土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2 185萬(wàn)，放線菌數(shù)約為477萬(wàn)，霉菌數(shù)約為23.1萬(wàn)。結(jié)

15、論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件。,（四）取樣涂布,◆實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等。,◆如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30—300的平板，則說(shuō)明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。,每個(gè)稀釋度下需要3個(gè)選擇培養(yǎng)基（作重復(fù)組），1個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（作

16、對(duì)照）,㈤.微生物的培養(yǎng)與觀察,在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。,培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d霉菌：25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。,微生物的培養(yǎng)與觀察,同種微生物有穩(wěn)定的菌落特征：形狀，大小，隆起程度，顏色,（六）鑒定：篩選后必鑒定 鑒別培養(yǎng)基：加入某種指示劑或化

17、學(xué)藥品，不影響微生物的生存1、酚紅培養(yǎng)基：鑒定分解尿素的細(xì)菌。原理：脲酶催化尿素分解成氨→培養(yǎng)基堿性增強(qiáng)→ 酚紅變紅→脲酶陽(yáng)性2、伊紅—美藍(lán)培養(yǎng)基：鑒定大腸桿菌原理：代謝產(chǎn)物與伊紅—美藍(lán)結(jié)合→ 菌落呈黑色并帶有金屬光澤。,屬鑒別培養(yǎng)基，它并沒有促進(jìn)大腸桿菌的生長(zhǎng)和抑制其他微生物的生長(zhǎng),伊紅—美藍(lán)培養(yǎng)基是鑒別培養(yǎng)基，可以用來(lái)檢測(cè)自來(lái)水中的大腸桿菌是否超標(biāo)，因?yàn)榈拇x產(chǎn)物與伊紅—美藍(lán)結(jié)合，使菌落呈深紫色并帶有金屬光澤，使大腸

18、桿菌的菌落顯示出來(lái)，并沒有促進(jìn)大腸桿菌的生長(zhǎng)和抑制其他微生物的生長(zhǎng)。,例如：鑒別大腸桿菌培養(yǎng)基,大腸桿菌呈黑色中心 ,有或無(wú)金屬光澤,大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)上典型特征,三、操作提示,,無(wú)菌操作,做好標(biāo)記,規(guī)劃時(shí)間,（一）①培養(yǎng)物(即培養(yǎng)的目的菌種)中是否有雜菌污染?②以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落?,①對(duì)照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。 ②牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇

19、培養(yǎng)基的數(shù)目，說(shuō)明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。,四.結(jié)果分析與評(píng)價(jià),如果學(xué)生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn)，需要進(jìn)一步分析產(chǎn)生差異的原因。,（二）樣品的稀釋操作是否成功,如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30～300的平板，則說(shuō)明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。,（三）重復(fù)組的結(jié)果是否一致,接種,不接種,接種,接種,需將未接種的選擇培養(yǎng)基同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng),需設(shè)立牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行接種后培養(yǎng)，觀察兩種培養(yǎng)

20、基上菌落數(shù)目、進(jìn)行對(duì)比得出結(jié),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則(1)設(shè)立重復(fù)組：統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)時(shí)，要至少涂布三個(gè)平板作重復(fù)組，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性。(2)設(shè)立兩種對(duì)照組：,欄目鏈接,四.結(jié)果分析與評(píng)價(jià),2,2,,,,,,,,,,,,本課題知識(shí)小結(jié):,課后練習(xí),2.提示：反芻動(dòng)物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。 由于瘤胃中的微生物多為厭氧菌，接觸空氣后會(huì)死亡，因此分離其中能分解尿素的微生

21、物除了需要準(zhǔn)備選擇培養(yǎng)基外，還應(yīng)參照厭氧菌的培養(yǎng)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。,11．某化工廠的污水池中，含有一種有害的、難以降解的有機(jī)化合物A。研究人員用化合物A、磷酸鹽、鎂鹽以及微量元素配制的培養(yǎng)基，成功地篩選到了能高效降解化合物A的細(xì)菌(“目的菌”)。請(qǐng)分析回答下列問題。(1)培養(yǎng)基中加入化合物A的目的是篩選__________，這種培養(yǎng)基屬于__________培養(yǎng)基。(2)“目的菌”生長(zhǎng)所需的氮源和碳源是來(lái)自培養(yǎng)基中的________

22、__，實(shí)驗(yàn)需要振蕩培養(yǎng)，由此推測(cè)“目的菌”的代謝類型是__________。(3)培養(yǎng)若干天后，應(yīng)選擇培養(yǎng)瓶中化合物A含量____________的培養(yǎng)液，接入新的培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)，使“目的菌”的數(shù)量__________。(4)可采用__________的方法將“目的菌”接種到固體培養(yǎng)基上，通過__________ 法對(duì)“目的菌”的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，通常需要對(duì)菌落數(shù)為__________的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。(5)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，使用過的培養(yǎng)基

23、應(yīng)該進(jìn)行__________處理后，才能倒掉。,“目的菌”,選擇,化合物A,異養(yǎng)需氧型,減少,增加,稀釋涂布平板,活菌計(jì)數(shù),30～300,滅菌,1.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ?。?A.培養(yǎng)細(xì)菌　　 B.培養(yǎng)真菌　　 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3　　 C.CO2和

24、尿素 D.葡萄糖和尿素,實(shí)踐訓(xùn)練,C,D,3.下列說(shuō)法不正確的是（ ?。?A.科學(xué)家從70－80度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶 B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5個(gè)平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值 C.設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度 D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。4.為培養(yǎng)和分離出酵

25、母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（　?。?A.較多的氮源物質(zhì) B.較多的碳源物質(zhì) C.青霉素類藥物 D.高濃度食鹽,B,C,（09，寧夏，15分）（1）在大腸桿菌培養(yǎng)過程中，除考慮營(yíng)養(yǎng)條件外，還要考慮______、______和滲透壓等條件。由于該細(xì)菌具有體積小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、變異類型容易選擇、______、______等優(yōu)點(diǎn)，因此常作為遺傳學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)材料。 （2）在微生物培養(yǎng)操作過程中，為防止雜菌污

26、染，需對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿進(jìn)行________（消毒、滅菌）；操作者的雙手需要進(jìn)行清洗和______；靜止空氣中的細(xì)菌可用紫外線殺滅，其原因是紫外線能使蛋白質(zhì)變性，還能__________。 （3）若用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)大腸桿菌活菌的個(gè)數(shù)，要想使所得估計(jì)值更接近實(shí)際值，除應(yīng)嚴(yán)格操作、多次重復(fù)外，還應(yīng)保證待測(cè)樣品稀釋的_______。 （4）通常，對(duì)獲得的純菌種還可以依據(jù)菌落的形狀、大小等菌落特征對(duì)細(xì)菌進(jìn)行初步的_________

27、___。 （5）培養(yǎng)大腸桿菌時(shí)，在接種前需要檢測(cè)培養(yǎng)基是否被污染。對(duì)于固體培養(yǎng)基應(yīng)采用的檢測(cè)方法是_________。 （6）若用大腸桿菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用過的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物必須經(jīng)過_______處理后才能丟棄，以防止培養(yǎng)物的擴(kuò)散。,答案:（1）溫度 酸堿度 易培養(yǎng) 生活周期短 （2）滅菌 消毒 損傷DNA的結(jié)構(gòu) （3）比例合適 （4）鑒定(或分類) （5）將未接種的培養(yǎng)基在適宜的溫度下放置適宜的時(shí)