質譜技術在微生物鑒定和生物醫(yī)學中的應用

1、質譜技術在微生物鑒定和生物醫(yī)學中的應用,306醫(yī)院檢驗科 易勇2016.03,島津（梅里埃）MALDI TOF產品系列,Linear only MALDI-TOF,Linear and reflectron MALDI-TOF PSD capability,Linear and reflectron MALDI-TOF/TOF PSD & CID capability,Unique instrument

2、 MALDI-ion trap-TOF reflectron only MSn capability High resolution and high mass accuracy,布魯克 各類現代生物質譜：,離子阱,MALDI TOF/TOF,ESI-Q-TOF,FTMS,質譜儀的工作原理,質譜儀是利用電磁學原理，使帶電的樣品離子按質荷比進行分離的裝置。離子電離后經加速進入磁場中，其動能與加速電壓及電荷z有關，即

3、 m/z = 2U/v2 其中z為離子的電荷，U為加速電壓，m為離子的質量，v為離子初加速后的運動速度。具有速度v的帶電粒子進入質譜分析器的電磁場中，根據所選擇的分離方式，最終各種離子按質荷比（m/z）的不同實現分離。,電離源,質譜儀中產生離子的裝置稱為離子源(ion source)。電離源的功能是將進樣系統引入的氣態(tài)樣品分子轉化成離子

4、。由于離子化所需要的能量隨分子不同差異很大，因此，對于不同的分子應選擇不同的離解方法。通常稱能給樣品較大能量的電離方法為硬電離方法，而給樣品較小能量的電離方法為軟電離方法。 質譜技術中的幾種離子源,基質輔助激光解吸離子化 (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization，MALDI)2. 電噴霧離子化(Electrospray ionization，ESI),,,,,,,,,,,,,,,Sam

5、ple target,,,,Ion optics,,Linear detector,,Laser,MALDI-TOF MALDI: 線性工作原理,Mix matrix & sample on targetFire laser at matrix/sampleIonize sample (solid to gas phase)Accelerate / extract ionsSeparate ions in analyze

6、rRecord spectrum at detector,Time of flight (TOF) mass analyzer (field free),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,0,,20,,40,,60,,80,,100,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,10000,,20000,,30000,,40000,m/z,,,+ve mode[M+H]+ ions,,MALDI基質輔助激光解析附原理: St

7、reptococcus pneumoniae:,mass signals matching to ribosomal proteins (considering possible methionine cleavage and/or methylation) are marked in red~50% of peaks unambiguously represent ribosomal proteins,protein masses

8、obtained from the Swiss-Prot/TrEMBL sequence database,質譜儀的基本結構,一、真空系統質譜儀的離子產生及經過系統必須處于高真空狀態(tài)(離子源真空度應達1.3×10-4 - 3×10-5 pa，質量分析器中應達1.3×10-6 pa)。若真空度過低，則會造成離子源燈絲損壞、本底增高、副反應過多，從而使圖譜復雜化、干擾離子源的調節(jié)、加速極放電等問題。一般質譜儀

9、都采用機械泵預抽真空后，再用高效率擴散泵連續(xù)地運行以保持真空。圖5.1 質譜儀的構成,微生物鑒定方法,耗時,氣質法（GC-MS）脂肪酸，小分子糖,MALDI-TOF MS,21-Mar-24,10,微生物鑒定新方法（MALDI TOF）,比現有方法鑒定更多生物多樣性的病原體分析時間僅1-2 minutes,,現代微生物分類學:蛋白組學 & 基因組學,Protein,,,DNA,Genome,Proteome,DNA F

10、ingerprint,MassFingerprint,SpeciesDefinition & Determination,,,MALDI-TOF MS,12,12,,不同細菌代表性指紋圖譜不同,各菌種代表性峰型分布存在顯著差異，有助于鑒定各個菌種！,,,13,13,腸桿菌 （Enterobacteriaceae）MS圖譜示:科, 屬, 種特異性峰值,部分峰值是多數菌種共有的（如 m/z 4365:核糖體蛋白 L36),峰

11、值有 科, 屬, 種或 亞種-特異性,種間特異性代表峰值用來區(qū)分不同菌種,,,,核糖體蛋白不受生長條件影響,Mass spectra of Proteus mirabilis DSM 4479 at different incubation timesNo major qualitative changes in peak patterns distinguishing family, genus and speciesDecr

12、ease of signal intensity over timePresence and absence of peaksIdentification with >99% confidence,SARAMIS 工作流程,,微生物鑒定流程,生長在固體培養(yǎng)基上的菌落,全細胞 MALDI-TOF譜圖,數據庫中參考譜圖,輸出可信鑒定結果,找到匹配度最可信的譜圖,17,鑒定結果界面,只需數秒，全自動添加新采集數據至鑒定結果界面

13、！,不同顏色代表不同置信水平 深綠: 99.9% 淺綠: 90-99.9% 黃色: 85-90% 白色: 70-85%低于70%不顯示置信值紅色: 提醒復雜的結果,,匹配2種或以上菌種，置信度>99% :鑒定混合菌,SARAMIS鑒定混合菌種,A mass spectrum of a mixed sample containingPseudomonas aeruginosa and

14、 Achromobacter xylosoxidansShows peaks specific to both species,單核增生性李斯特菌Listeria monocytogenes (Lm) 兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌，自然界分布廣泛，是食源性李斯特?。ㄈ诵蠊不疾。┑闹虏≡?，低溫仍具有增殖能力對老年人，嬰兒，孕婦和免疫缺陷者的致死率是 20-30%該菌經常存在于速食食品中

15、Ex. About 2,500cases/year in USA,食品安全 Tokyo Marine University, Prof Kimura and Dr. Takahashi,,Eatable without heated and cocked or cocked food, ex., ham, daily product, salad, smoked food etc,現有檢測方法需要2步驟和選擇培養(yǎng)基，耗時6天,Yaku

16、lt (養(yǎng)樂多),乳酸菌生產質量控制品種改良Performance + SARAMIS,Classified as genus => species => strain“Thickness” of database is important.,,From 2011 European society of clinical microbiology and infections disease,菌種鑒定準確度,21-

17、Mar-24,22,SARAMIS：Spectral ARchive And Microbial Identification System,數據庫含有超級譜圖（ SuperSpectra ）和參考譜圖（ Reference Spectra ）使用者可以創(chuàng)建和儲存超級譜圖或參考譜圖軟件包可實現譜圖的存儲，分析和比較使用者可以做聚類分析，創(chuàng)建系統樹圖用于菌株分型,SARAMIS 菌種特異峰型,,合成譜圖包含所有在個體譜圖中出

18、現頻率大于閥值的所有峰 (如：在各譜圖中出現 70% 的)在超級譜圖中，所有峰值根據他們對所代表的菌種特異性而賦予權重值具有科、屬特異性的峰值權重低，這些峰值不支持菌種鑒定具有菌種特異性的峰值權重則會加重,,,,SARAMIS – 比較工具,,,Cluster analysis of selected reference and sample mass spectra,Comparison to mass spectral pa

19、tterns of reference spectra in the database,,,,,,在SARAMIS數據庫中一個菌種的典型代表包含典型和非典型菌株（基于質譜圖譜，基因組學，表型數據）,,,,,,,,atypical reference isolates are over-represented in SARAMIS,,,,,phylogenetic distance,phylogenetic distance,freque

20、ncy,frequency,自然界菌種多樣性,,SARAMIS與LIMS系統,,Culture from the stock in gricelol,Culture in various conditions,Collect isolates from our lab and other facilities (10),Measure MS spectra and construct Database,,,Apply to uncert

21、ainty, which reduce stability of identification,Difference in colony in a same media ? 2HW product tolerance ? 3 systemOperator ? 12peopleCulture media ? maximum 5 kinds Culture length ? 24, 48, 72h Culture ven

22、der? 3 venders,Max 3,240 spectra,深度透視數據庫,MicroID system intrucduction,Version 1.0,自動鑒定界面,比對鑒定界面,MicroID,MALDI-TOF MS 微生物鑒定優(yōu)勢,一種對所有微生物都適用的方法無需預選測試與現代分類學結果一致高度配合有特殊需求使用者可擴展新菌種及其應用非常耐用且重復性高樣品準備過程非常簡化可進行高通量分析絕佳成本與效益比

23、,32,AXIMA MALDI: 線性 & 反射不只是微生物鑒定,MALDI TOF全面解決方案,布魯克 各類現代生物質譜：,離子阱,MALDI TOF/TOF,ESI-Q-TOF,FTMS,高分辨質譜儀 全方位應用,天然產物分析藥物研究蛋白質組學代謝組學............,,,micrOTOFQ,micrOTOFQ,,,Dry Gas Heater,Orthogonal Accele

24、rator,Glass Capillary,Collision Gas Supply,Hexapole,電噴霧離子源,去溶劑系統,飛行管,檢測器,反射鏡,離子聚焦系統,離子漏斗式傳輸,,四級桿Q,碰撞池,布魯克公司獨家專利設計：離子漏斗式傳輸系統,離子流方向>>>,離子傳輸率大大提高，從而提高靈敏度。增寬傳輸離子質量范圍,離子流方向>>>,傳統的錐式離子傳輸,micrOTOFQ適用范圍

25、：,電噴霧四級桿飛行時間串聯質譜儀,精確質量 (<3ppm),micrOTOFQ：獨特的三維信息,MS/MS提供結構信息,電噴霧四級桿飛行時間串聯質譜儀,SigmaFit?參數（同位素峰形匹配）,精確質量 (<3ppm),micrOTOFQ：獨特的三維信息,MS/MS提供結構信息,電噴霧四級桿飛行時間串聯質譜儀,SigmaFit?參數（同位素峰形匹配）,,SigmaFit?參數—— 同位素峰形的匹配,,,,,2,,,1,,,

26、3,,,4,,,5,,,6,,,7,,,8,,,9,,,10,,,11,,,,,,,C254H383N65O75S6 ,5735.65,,,0,,,,2000,,,,4000,,,,6000,,,,Intens.,,,,,1146.0,,,,,,,1146.5,,,,,,,1147.0,,,,,,,1147.5,,,,,,,1148.0,,,,,,,1148.5,,,,,,,1149.0,,,,,,,1149.5,,,,,,,1150.

27、0,,,,,,,m/z,,,1,,,2,,,3,,,4,,,5,,,6,,,7,,,8,,,9,,,10,,,11,,,,模擬同位素分布峰形,實測同位素分布峰形,SigmaFit?參數—— 同位素峰形的匹配,SigmaFit 參數 =0,SigmaFit 參數 >>0,,,436.0398,Experimental,,,436.0400,C12H22NO10S3,,,436.0367,C15H18NO10S2,,0,,,2,

28、,,4,,,6,,,,0,,,2,,,4,,,6,,,,435,,436,,437,,438,,439,,440,,441,,442,m/z,sigma = 0.0167,sigma = 0.0231,Intensity x 104,A,B,C,鑒定化合物的有效工具-- SigmaFit,,兩種可能元素組成的確定,分子量 >500Da未知物的元素組成預測？,人參提取液（稀釋倍數 1:100; HPLC-microTOF Q）,

29、當設置誤差范圍 <5 ppm時：,,,,171個可能的分子式,Generate Molecular Formula,,,16個可能的分子式,當設置誤差范圍 < 3ppm 時：,Generate Molecular Formula,,C55H93O25,,用SigmaTM參數比較同位素峰形匹配，選擇Sigma值最小的分子式，即該化合物的分子式為：,Generate Molecular Formula,SigmaTM參數用于比較

30、同位素峰形匹配,,,,,,,,1153.60114,1154.60456,1155.60742,1156.61021,C55H93O25 ,1153.60,,,,,,,,1153.59527,1154.59868,1155.60170,1156.60459,C62H89O20 ,1153.59,,0,,,,,,500,,,,,,1000,,,,,,1500,,,,,,2000,,,,,,2500,,,,,,Intens.,,0,,,,,

31、,500,,,,,,1000,,,,,,1500,,,,,,2000,,,,,,2500,,,,,,,,,,1153,,,,,,1154,,,,,,1155,,,,,,1156,,,,,,1157,,,,,,1158,,,,,,1159,,,,,m/z,C55H93O25,C62H89O20,SigmaTM = 0.0171,SigmaTM = 0.0540,,,,,未知多肽測序測定 GluFib: MS/MS of m/z = 78

32、5.8 (+2),—— 動態(tài)范圍的實際意義,高質量準確度測定與液質聯用,常規(guī)高分辨質譜儀在液質聯用時面臨的挑戰(zhàn),,LC/MS高質量準確度測定在法醫(yī)藥物監(jiān)測中的應用Dept. of Forensic MedicineUniversity of Helsinki, Finland,Rapid Commun. Mass Spectrum 2006; 20: 1161-1167,尿樣 – 法醫(yī)毒理分析,總離子流色譜圖 TIC,準確質量

33、動態(tài)范圍forensic screening: positive hits,error: 2.98 ppmsigma: 0.0165,error: 0.19 ppmsigma: 0.0084,Signal intensity: 8 x103,Signal intensity: 2 x106,布魯克集團公司,Affiliated Companies,,,,,豐收：土地、種子、氣候......質譜儀細菌鑒定：細菌純培養(yǎng)、完善的數