毒理學新技術

1、體外試驗與生物新技術在毒理學中的應用,分類,依據(jù)體外試驗在決策過程中所起的作用篩選試驗。它僅提供決策過程的最初的資料，還需要進行更權威的試驗，無論是整體還是體外試驗。附加試驗。它可為協(xié)作部門或法律部門的最終決策過程提供有用的資料，如機理的研究，但僅有它是不夠充分的。替代試驗。它是在大量實驗的基礎上，使體外毒性試驗能替代整體動物試驗，以提供更多的信息。,基本原理,體外試驗的基本原理是所觀察到的毒理學效應均是毒物和／或反應活性代謝產(chǎn)物

2、在敏感性細胞上或敏感細胞內(nèi)某一分子靶部位作用的結(jié)果。,體外毒性試驗系統(tǒng)的優(yōu)點,能控制環(huán)境因素可排除相互作用的系統(tǒng)如免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響每一劑量水平可利用大量的生物樣品，如細胞，細胞器等試驗間的誤差較少可同時和／或反復多次取樣可做成復雜的互相作用的試驗系統(tǒng)，如復合細胞培養(yǎng)等較為快速和經(jīng)濟需要較小量的受試化合物產(chǎn)生較小量的有毒廢物可以利用人體細胞減少整體動物的使用,體外試驗系統(tǒng),臟器灌流 肝臟灌流 腸灌流

3、 膈肌-膈神經(jīng)標本 臟器切片 原代細胞培養(yǎng) 肝細胞原代培養(yǎng)巨噬細胞 淋巴細胞 腦細胞 心肌細胞 細胞培養(yǎng) 組織勻漿,亞細胞組分 細胞膜 微粒體 線粒體 酶,哺乳動物細胞制備和培養(yǎng),體外系統(tǒng)分離的細胞包括懸浮液中的新鮮游離細胞、原代培養(yǎng)細胞、細胞株、細胞系及復合培養(yǎng)的細胞 在毒理學中以哺乳動物細胞作為實驗動物的替代系統(tǒng)的原因 來自公眾要求減少實驗中使用動物數(shù)量的壓力整體動物實驗可顯著地減少常規(guī)整體動物實驗

4、所需的高額費用人們越來越不滿意實驗動物與人體結(jié)果之間相關性的缺乏。,體外系統(tǒng)——細胞在毒理學中應用的優(yōu)、缺點,優(yōu)點 改善效率，減少費用 使用實驗動物較少 僅需少量的受試物 較大程度控制細胞族的性狀 直接控制胞外基質(zhì)、化學物濃度及接觸時間 排除可能的混淆因素如激素；神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)的影響

5、 可從同一實驗體系重復取樣缺點 缺少整個器官的形態(tài)學觀察 選擇性喪失整體器官特異性功能，如毒性代謝酶的喪失 缺乏可能的調(diào)節(jié)影響因素如激素，神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)， 一般為靜態(tài)系統(tǒng)，將導致營養(yǎng)物質(zhì)的逐漸減少和代謝終產(chǎn)物的逐漸累積。 多為短期試驗，對亞慢性或慢性毒性的評估價值不大,毒理學研究中常用細胞,各種物種的成纖維細胞淋巴母細胞腹水

6、瘤細胞淋巴細胞角質(zhì)細胞肝 細 胞肝癌細胞腎臟髓質(zhì)和皮質(zhì)細胞,肺的各種類型細胞培養(yǎng)的背根膠質(zhì)細胞培養(yǎng)的睪丸細胞膀胱細胞心臟細胞脊髓微血管細胞脂肪細胞,細胞實驗方法,建立正在迅速生長的細胞株，用以觀察受試物對整體細胞的一般毒作用和正在分裂組織的毒作用利用已高度分化的細胞，無論是原代培養(yǎng)或是特定的細胞株，研究受試物對已分化成熟的細胞或其功能的特殊毒作用；,細胞培養(yǎng)的基本條件,無菌條件：凈化工作室，風淋室，傳遞窗，高效過

7、濾器，　　　　　潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺，紫外　　　　　燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌器，抗生素 細胞生長條件：純水蒸餾器，純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶， 　　　　　　　CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清細胞檢測條件：倒置顯微鏡，酶標儀 ，微孔板震蕩器，高　　　　　　　速離心機，移液器 細胞保存條件：液氮罐實驗室安全：生物實驗室安全，P1,P2,P3實驗室安全,風淋室:　　風淋室是生物潔凈室的理想配套設備，它不僅可以清除人

8、體和物品表面附著的塵埃，減少帶入潔凈室的灰塵量，而且兼有氣閘室的功能，可防止非潔凈空氣的侵入。,傳遞窗:　　該裝置是一種潔凈室的輔助設備，主要用于潔凈區(qū)與潔凈區(qū)，潔凈區(qū)與非潔凈區(qū)之間小件物品的傳遞，以減少潔凈室的開門次數(shù)，把對潔凈區(qū)的污染降低到最低程度。,超凈工作臺,,超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅(qū)動空氣，通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構成無菌環(huán)境。,培 養(yǎng) 板,培養(yǎng)瓶,酶

9、標儀 微孔板震蕩器,培養(yǎng)細胞生長的條件,1 細胞的營養(yǎng)需要2 細胞的生存環(huán)境 溫度: 37 ℃，O2 　CO2: 5%，CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 滲透壓 3 無污染 4 無毒,細胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖

10、液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至

11、1000 ml,胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％ 。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用,消化液：,培養(yǎng)基：,培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，

12、分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限。 成分復雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染,合成培養(yǎng)基,,主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低 。 缺點： 缺少某些成分不能完全滿足細胞生長需要。

13、　如 TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。,無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時還需添加血清。 一般說來，含5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細胞可以維持細胞不死，但支持細胞生長一般需加 10％血清．,血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關鍵。常用血清有胎牛血潔、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。血清

14、的滅活（消除補體活性）：56 ℃ ，30 分鐘血清的消毒：過濾除菌,抗菌素的使用： 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長。 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。 慶大霉素：每毫升100單位——方便、廣譜、穩(wěn)定。,基礎培養(yǎng)基 80％一95％血清

15、5％一20％碳酸氫鈉 2.0 g/L青、鏈霉素 各100單位／毫升,完全培養(yǎng)基的組成,RPMI-1640培養(yǎng)粉 1袋 碳酸氫鈉 2.0 g 青、鏈霉素 各100單位／毫升 加三蒸水 至 1000ml, 過濾除菌； 調(diào)節(jié)pH值至7.2； 加

16、血清（終濃度 10％）。,培養(yǎng)基的配制,主要培養(yǎng)基,MEM：低限量Eagle培養(yǎng)基DMEM：貼壁細胞IMDM：密度低、生長困難細胞，雜交瘤細胞RPMI1640：懸浮、腫瘤、原代、傳代等細胞199、109培養(yǎng)基：原代培養(yǎng)、難以培養(yǎng)的細胞,細胞培養(yǎng)基本技術,,無菌操作技術,體外培養(yǎng)細胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。,【培養(yǎng)前準備】 在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。根據(jù)實驗要求，準備各

17、種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內(nèi)，然后開始消毒。避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會。,【操作與消毒】 無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(專用拖布)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺面消毒時切勿將培養(yǎng)細胞和培養(yǎng)用液同時照射紫外線，物品不要重疊放置。移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精

18、擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。,【火焰消毒】 首先要點燃酒精燈。按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行。,【操作】 進行培養(yǎng)時，動作要準確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動。,培養(yǎng)細胞的觀察,１．肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度２．倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài),細胞計數(shù),培養(yǎng)的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進行細胞計數(shù)。計數(shù)結(jié)果以每毫升細胞數(shù)表示。細胞計數(shù)的原理和方法與血細胞計數(shù)相同。血細

19、胞計數(shù)器：手工計數(shù)細胞,細胞計數(shù)：　 1、將計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，將蓋片蓋在計數(shù)板上。　 2、吸少許細胞懸液，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間?！?3、靜置3分鐘?！?4、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：　　細胞數(shù)/ml＝4大格細胞總數(shù)/ 4×10000　　注意：若兩個以上的細胞團，按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，需重新制備細胞懸液。,根據(jù)細胞生長的恃點

20、，傳代方法有3種：1懸浮生長細胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。,細胞傳代方法,2．半懸浮生長細胞傳代（Hela細胞） 此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。3．貼壁生長細胞傳代 采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25

21、％的胰蛋白酶液。,總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力檢測的細胞：組織分離的細胞復蘇后的細胞,培養(yǎng)細胞活力測定,1．臺盼藍法活細胞不被染色，死細胞染成藍色；方法： 1、將細胞懸液以0.5ml加入試管中； 2、加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘； 3、鏡檢計細胞活力。 死細胞深蘭色，活細胞呈無色透明狀。,2．四唑鹽（MTT）比色法四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍；原理：活細胞中脫氫酶能

22、將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產(chǎn)物，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解藍紫色，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。酶標儀測定OD值。,,,細胞凍存和復蘇,細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規(guī)工作。凍存和復蘇的原則：慢凍快融慢凍程序： 將冷凍管放入紗布袋內(nèi)，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投入液氮中。常用的低溫保護劑是DMSO,細胞

23、復蘇方法,（1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～38 ℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）；　 （2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上；　　（3）低速離心10分鐘；　?。?）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復蘇的細胞。,培養(yǎng)細胞的生物學特征,植物輸導水分的細胞,哺乳類的肌肉細胞,人類脊髓神經(jīng)細胞,體外培養(yǎng)細胞的分型,（一）貼附型： 大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞，大致分成以下四型：,培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程,

24、（一）培養(yǎng)細胞生命期（Life Span of Culture Cells）　　所謂培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。,1．原代培養(yǎng)期　　即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構和功能活動上相似性大。各細胞的遺傳性狀互不相同，依存性強，獨立生存性差。,2．傳代期：　　初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便改稱做細胞系。呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系。為保持二倍體細胞性質(zhì)，細胞應在

25、初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下當傳代10～50次左右，細胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細胞進入第三期。,3．衰退期：　　生存，但增殖慢或不增殖；最后衰退凋亡。由于某種因素的影響，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的標志之一是細胞可能獲得永生性即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系，主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。,（二）組織培養(yǎng)細胞一代生存期,所謂細胞“一代”一詞，系僅指從細胞接種

26、到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習慣說法，它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代（Generation）或倍增〔Doubling）不同；在細胞一代中，細胞能倍增3～6次。細胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個階段：,2．指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase）：　　這是細胞增值最旺盛的階段，細胞分裂相增多。指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細

27、胞生長旺盛與否的一個重要標志。一般以細胞分裂指數(shù)表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)。一般細胞的分裂指數(shù)介于0.1%～0.5%，初代細胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂指數(shù)可高達3%～5%。,在接種細胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后，隨細胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（Contact Inhibit

28、ion）?！　〖毎佑|匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數(shù)量仍在增多。但當細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制（Density Inhibition），導致細胞分裂停止。,特點：　　是細胞增生最活躍、活力最旺盛的階段　培養(yǎng)物中細胞數(shù)量呈指數(shù)增長,細胞群體均一　是理想的實驗用細胞。,判斷細胞生長的指標：指數(shù)生長期內(nèi)細胞

29、分裂活動的程度(增殖活性)可作為判斷細胞生長是否旺盛的重要指標1.有絲分裂指數(shù)(MI):　　指培養(yǎng)物中分裂相數(shù)量占全部細胞數(shù)量的百分比，統(tǒng)計時，每瓶至少需計數(shù)1000個細胞?！∫话慵毎腗I約為0.1－0.5%；原代培養(yǎng)物的MI比繼代培養(yǎng)物低。連續(xù)細胞系和腫瘤細胞高，可達3%－5%。,判斷細胞生長的指標：2.細胞群體倍增時間:　培養(yǎng)物中細胞數(shù)量翻倍的平均時間3.MTT法：反映細胞內(nèi)一種酶活性程度4.標記核苷酸(3H-Td

30、R)摻入量：反映DNA,細胞生長一定階段(指數(shù)生長期一般持續(xù)3－5 d）,即可長滿培養(yǎng)器皿，相互匯合成片(鋪滿 confluence) 當細胞相互接觸連接成片，出現(xiàn)接觸抑制，接觸抑制以后，雖然運動受抑制，但只要營養(yǎng)成分充足，仍可短期的分裂增殖，只有當細胞密度增大到一定程度，細胞便不再分裂增殖。為密度依賴性細胞生長抑制當細胞分裂停止后，細胞數(shù)量即不再增加進入平臺期,3．停滯期（Stagnate Phase）：　　細胞數(shù)量達飽和密

31、度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺期（Plateau）。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細胞的機能狀態(tài)。在這種情況下，雖進行了傳代，因細胞已受損，需要恢復，至少還要再傳1～2兩代，通過換液淘汰死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復后，才能再用。,概述 細胞鋪滿后再1-2倍增, 進入細胞達飽和密度, 可存活仍有

32、代謝活動，但基本不分裂， 細胞數(shù)量維持在某一水平上，生長活動停滯,特點 (1)細胞數(shù)量： 細胞達飽和密度，出現(xiàn)密度抑制。 停止生長原因: 細胞數(shù)量多、生長地區(qū)占滿、營養(yǎng)消耗、培養(yǎng)液中代謝廢物積聚漸多，細胞停止生長。　　即使經(jīng)常更換培養(yǎng)液，細胞也會變性,從生長基質(zhì)表面脫落、死亡唯有進行傳代方可緩解。,(2)細胞活動小, 細胞膜的　活動小(3)生長組分下降: 0－10%(4)及時傳代：細胞已中毒，即

33、使傳代，也會影響下一代細胞的功能狀況,?,體內(nèi)細胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代（Passage或Subculture）。,體外培養(yǎng)細胞的種類,（一）初代培養(yǎng) 初代培養(yǎng)又稱原代培養(yǎng)，即直接從體內(nèi)取出的細胞、組織和器官進行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進行傳代培養(yǎng)（Subc

34、ulture）的細胞，便不再稱為初代培養(yǎng)，而改稱為細胞系。,（二）細胞系 初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細胞，即稱之為細胞系。如細胞系的生存期有限，則稱之為有限細胞系（Finite Cell Line）；已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細胞系，稱連續(xù)細胞系或無限細胞系（Infinite Cell Line）。無限細胞系大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細胞，因此本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞系。無限細胞系有的只有永生性（

35、或不死性），但仍保留接觸抑制和無異體接種致癌性；有的不僅有永生性，異體接種也有致瘤性，說明已惡性化。,（三）細胞株  從一個經(jīng)過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細胞株。再由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細胞群，亦可稱之為亞株（Substrain）,（四）二倍體細胞 細胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍細胞染色體數(shù)相同或基本相同（2n細胞占75％或80％以上）的細胞

36、群，稱二倍體細胞培養(yǎng)。如僅數(shù)目相同，而核型不同的即染色體形態(tài)有改變者為假二倍體。二倍體細胞在正常情況下具有限生命期，故屬有限細胞系。但隨供體年齡和組織細胞的不同，二倍體細胞的壽命長短各異。人胚肺成纖維細胞可傳50代土10代，人胚腎只有8～10代，人胚神經(jīng)膠質(zhì)細胞15～30代。由不同年齡供體取材建立的二倍體細胞系可供研究衰老之用。為保持二倍體細胞能長期被利用，一般在初代或2～5代即大量凍存作為原種（Stook Cells），用時再進行繁殖

37、，用后再繼續(xù)凍存，可供長期使用或延緩細胞的衰老。,（五）遺傳缺陷細胞 從有先天遺傳缺陷者取材（主要為成纖維細胞）培養(yǎng)的細胞，或用人工方法誘發(fā)突變的細胞，都屬遺傳缺欠細胞。這類細胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體。,（六）腫瘤細胞系或株 這是現(xiàn)有細胞系中最多的一類，我國已建細胞系主要為這類細胞。腫瘤細胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細胞，常已傳幾十代或百代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。,細胞系或細胞株的命名,HeLa：

38、為供體患者的姓名（來源于宮頸癌）CHO：中國地鼠卵巢細胞（Chinese Hamster Ovary）宮-743：宮頸癌上皮細胞，1974年3月建立NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究院（National Institute of Health）建立；每3天傳代，每次接種3×105細胞／毫升。,基本技術,儀器與設備 1. 培養(yǎng)箱 2. 冰箱和冷柜 冰箱(4℃) ，冷柜(—20℃)3. 顯微鏡 ，相差顯微鏡或熒光顯微鏡

39、，并附有照相裝置或攝影裝置。 4. 超凈工作臺 5.電熱干燥箱消毒 器皿的清洗可用超聲波洗滌器。6. 培養(yǎng)器皿 ；①多孔培養(yǎng)板，其規(guī)格有4孔、6孔、24孔及96孔，它體積小，適于少量細胞或單個細胞克隆的生長；②培養(yǎng)皿，③培養(yǎng)瓶，；④其它：凍存細胞的塑料安瓿及微量加樣器頭，。 ①吸管，它包括刻度吸管和移液管，常用規(guī)格有l(wèi)0ml，5ml和lml；②玻璃瓶， ③離心管， 7. 液氮貯存器 8. 水純化裝置 但

40、是，在細胞培養(yǎng)中，不宜使用去離子純水，因其不能有效地去除有機物。 9. 濾過消毒裝置,三、培養(yǎng)細胞的鑒定,目的：觀察培養(yǎng)有無變化，以決定是否終止培養(yǎng)，并從冷凍貯存的樣品重新建立新的培養(yǎng)細胞；培養(yǎng)條件(如培養(yǎng)液)變化，對培養(yǎng)細胞的影響。鑒定污染鑒定生存指標細胞性質(zhì)(如細胞形態(tài)、生長特性、染色體數(shù)目及結(jié)構等)。,污染鑒定,細胞培養(yǎng)中常見的污染有真菌、細菌和支原體等，此外有化學物和非同一種細胞的污染。污染表現(xiàn)：細胞培養(yǎng)可明顯

41、地改變生長特性，引起pH變化和生長遲緩培養(yǎng)液表面起泡或起膜，培養(yǎng)液中的絮狀物及細胞生長表面的斑點，搖動培養(yǎng)器皿可消失。,肉眼見不到的污染可影響細胞的代謝。,細胞特性鑒定,1. 形態(tài)學檢查：評價細胞正常與否的最簡單方法是形態(tài)學檢查 。“成纖維樣”“上皮樣 2.生長特性的檢查主要通過測定更換培養(yǎng)液的時間和傳代的時間來完成 接種效率=小于30表示生長不正常 3.其它檢查 除上述指標外，在細胞培養(yǎng)時，可進行染色體分析，包括

42、染色體的數(shù)目和結(jié)構以及DNA、RNA和蛋白質(zhì)的含量測定，來判斷培養(yǎng)細胞的特性。,,細胞培養(yǎng)在食品毒理學中應用,一般毒性：主要為急性細胞毒性 器官特異性毒性：利用有代表性細胞類型如肝細胞、腎近曲小管細胞、神經(jīng)細胞及心肌細胞等： 毒作用機理 生物轉(zhuǎn)化、毒性代謝產(chǎn)物的形成 遺傳毒性，如程序外DNA合成測定 繁殖毒性 聯(lián)合毒性 不同物種間的比較毒性 光敏

43、毒性,毒性指標的選擇,依據(jù)不同的試驗目的和試驗條件，可選擇不同的觀察指標。下列指標在毒理學中經(jīng)常采用： (1) IC50：即經(jīng)3天培養(yǎng)后，引起生長速率減至對照組一半時所需受試物的濃度生長速率可用蛋白總濃度來表示，可用于細胞毒性的常規(guī)篩檢。此外，前述評價細胞特性的指標，如形態(tài)學和接種效率等，均可采用。 (2) 細胞膜損傷：可選擇臺盼藍攝取、胞漿酶漏出、Ca2+的釋放以及鈣泵的變化等指標來評價細胞膜的損傷。 (3)

44、大分子物質(zhì)合成與降解的改變：可選用[14C]亮氨酸蛋白試驗和[3H]尿嘧啶參入RNA試驗等指標，以判斷受試物對培養(yǎng)細胞的大分子合成與降解的有無作用。 (4) 代謝能力：除可選擇ATP濃度、NADP／NADPH比、谷胱甘肽含量、氧消耗量等指標外，還有毒物代謝酶的活性、細胞膜脂質(zhì)過氧化作用及[14C]-葡萄糖氧化代謝成14CO2的速率，均可反映出細胞的代謝能力。 (5) 形態(tài)學觀察：通過光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察，可

45、了解受試物對培養(yǎng)細胞的形態(tài)改變情況。,毒理學中應用細胞培養(yǎng)技術時應注意的幾個問題,1. 細胞類型的選擇 細胞類型的選擇取決于實驗的目的。一般性篩選系列化合物的一般毒性時，應選擇生長迅速且易于處理的細胞系。機理研究多不用細胞系，因為培養(yǎng)的細胞會逐漸喪失許多功能，如細胞色素P-450的活性。 細胞培養(yǎng)的優(yōu)點之一是可選擇來源于人體的組織細胞，可減少試驗結(jié)果的物種差異。成纖維樣細胞和上皮樣細胞均可選用。常用的細胞系有CH

46、O、V79、Hela、BHR及L929等。,2. 代謝活化,細胞經(jīng)8-24h培養(yǎng)后，細胞色素P-450活性將迅速下降。而在CHO細胞系中，涉及代謝活化的酶活性下降。所以，培養(yǎng)細胞對需代謝活化的化學物不能夠敏感。 解決方法，一是加S9。 S9需要NADPH才具有代謝活化作用，故在培養(yǎng)液中應加有NADPH生成系統(tǒng)(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸和NADP)。與原代肝細胞復合培養(yǎng)。與原代肝細胞進行復合培養(yǎng)時也可采用其它不同的

47、細胞系，如V79、中國地鼠肺成纖維細胞和人成纖維細胞。,3. 受試物的給予,許多受試物由于水溶性較低，在加入培養(yǎng)液前，常需溶于有機溶劑，有機溶劑對細胞有損害作用，故應限制有機溶劑濃度在1％以下。在試驗中可設立適當?shù)挠袡C溶劑對照和培養(yǎng)液對照。,4.設立陽性對照組,實驗系統(tǒng)的重現(xiàn)性應該用陽性對照物來檢查。陽性對照物指采用經(jīng)過研究或公認有特定作用的化學物。,亞細胞組分制備及其檢測方法,微粒體的制備肝微粒體制備肝外組織微粒體的制備 線粒

48、體的制備亞線粒體顆粒的制備,設備,設備勻漿器離心機：低溫高速離心機，最大轉(zhuǎn)速為18 000～24000rpm，超速離心機，最大轉(zhuǎn)速為50000～75000rpm。 勻漿介質(zhì)和緩沖液最常用的勻漿介質(zhì)為等滲的蔗糖(0.25mol／L)和氯化鉀(0.154mol／L) 生物樣品 實驗動物如大鼠、小鼠、金黃地鼠應迅速處死，常用的方法是斷頭處死。應避免使用麻醉劑，如乙醚、巴比妥類藥物，它們將影響毒物代謝酶的活力。,肝微粒

49、體制備,,,,,,,,,肝勻槳,離心，10000g 20 min,上清液 沉淀,離心，10500g 1h,沉淀 （微粒體） 上清液棄去,線粒體的制備,,,,,,,,,肝勻槳,離心，460g 10 min,上清液 沉淀(包括

50、細胞核，紅細胞,離心，12500g 10 min 及大的細胞碎片),沉淀 （含有線粒體） 上清液 棄去,整個制備過程應在1h內(nèi)完成,,,,,,細胞碎片和紅細胞,,大量完整的線粒體和一些溶酶體,,一些破的線粒體和微粒體,,細胞程序性死亡及其檢測方法,細胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)是一種與遺傳機制有關的、主動的自

51、發(fā)性死亡方式，并在形態(tài)和生化上出現(xiàn)一系列特征表現(xiàn)。具有這些特征表現(xiàn)的細胞稱為細胞凋亡(apoptosis)。細胞凋亡：而細胞凋亡的特征表現(xiàn)是胞內(nèi)水分丟失，胞漿濃縮，胞膜結(jié)構完好，細胞核濃縮聚集于核膜邊緣，形成新月形。到晚期，細胞核碎裂成小片，胞漿分割，形成由細胞膜所包繞的含有核碎片的小體，稱為凋亡小體(apoptotic body)。細胞壞死(necrosis) ：壞死是指體內(nèi)、外致?lián)p傷因素作用達到一定強度、持續(xù)一定時間后，所導

52、致的細胞死亡，它表現(xiàn)為細胞及細胞器腫脹、碎裂和溶解等。,細胞程序性死亡的檢測方法,1. 形態(tài)學觀察法 主要依靠光學顯微鏡或電子顯微鏡觀察細胞凋亡的形態(tài)學特點。觀察材料可以是石蠟切片、冰凍切片或細胞涂片。形態(tài)學觀察可用HE染色或熒光染料PI、DAPI等染色。,normal,,,掃描電鏡,,透射電鏡觀察,,電泳檢測法,原理是在細胞發(fā)生凋亡時，由于內(nèi)源性核苷酸酶的激活，DNA被有規(guī)律地切割成約180bp或其倍體的雙鏈DNA片段，在凝膠電

53、泳上可形成梯帶，即具有凋亡的特征DNA梯帶(DNAladder)。,,，,單細胞凝膠電泳,將細胞包埋于低熔點瓊脂糖內(nèi)，置于堿性裂解液中，使細胞裂解后，瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色，觀察細胞DNA的斷裂情況。,末端轉(zhuǎn)移標記法,末端轉(zhuǎn)移標記技術是利用在發(fā)生凋亡時，DNA鏈被激活的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶切割成許多180bp左右的雙鏈DNA片段。這些片斷均含有3?-OH末端，在末端轉(zhuǎn)換酶或DNA多聚酶，(TdT酶)作用下，加入已標記的核苷酸或核苷酸混

54、合物，再經(jīng)過酶顯色或用熒光抗體使之顯示出來。,細胞分析儀檢測法,常用的細胞分析儀有兩類，流式細胞分析儀，可對單個細胞懸液中的單個細胞進行檢測。借助細胞標記技術和計算機分析技術，可快速檢出發(fā)生凋亡的細胞。其原理是在正常增殖狀態(tài)的細胞，處于不同周期時相，即G0／Gl，S1，G2／M期，其DNA含量分布在2n～4n之間；。 細胞形態(tài)分析儀，可對載玻片上單個細胞進行檢測。,,二、細胞凋亡相關基因,現(xiàn)已報道，有25個癌基因與細胞凋亡有關。

55、細胞凋亡相關基因大致可分為兩大類，即凋亡促進（apoptosis on）基因和凋亡抑制（apoptosis off ）基因。它們分別起著促進凋亡和抑制凋亡的作用，彼此之間還存在一定的相互關聯(lián)。1．凋亡抑制基因凋亡抑制基因包括bcl-2、ced-9、bcl-X，其中最主要也是當前研究最多的是bcl-2，bcl-2是癌基因的一種，在人體多種形態(tài)的腫瘤中過度表達，可抑制由多種剌激包括化療和放療引起的細胞凋亡。bcl-2常在淋巴細胞系統(tǒng)和神

56、經(jīng)系統(tǒng)中表達，抑制該部位的細胞凋亡。淋巴性白血病細胞中bcl-2也是過度表達的。,,2．凋亡促進基因凋亡促進基因有ced-3,4、p53、ICE、Bax、bcl-Xs、TGFβ等。其中ced-3，4是在線蟲索中發(fā)現(xiàn)的，而p53、ICE等存在于哺乳動物中。p53為腫瘤的抑制基因，分為兩型，一型是使細胞周期停止在GI期，抑制細胞繁殖的野生型；另一型是具有突變能力的變異型。野生型p53可誘導易感細胞發(fā)生凋亡。白介素1β轉(zhuǎn)換酶（inter

57、lukin 1-β-converting enzyme, ICE）,與線蟲細胞凋亡相關基因ced-3有較高的同源性，具有直接誘導細胞凋亡的作用。c-myc是典型的原癌基因，在許多腫瘤中它有多種失活形式。c-myc的表達驅(qū)動細胞凋亡，這與細胞所處的條件有關,凋亡基因之間的相互作用,bcl-2能妨礙依賴p53的凋亡，但不影響依賴p53的生長停滯，可是將bcl-2與c-myc共表達時，這兩者都被阻斷。一個主要顯性癌基因c-myc與一個抗凋

58、亡基因bcl-2的協(xié)同作用會導致腫瘤向惡性表型進展，并對腫瘤治療的抗性增加，而p53和bcl-2間的相互拮抗作用則有利于抗腫瘤治療。,凋亡細胞特有的生化改變,(1)Ca2+活化胞漿蛋白酶，稱為ICE已發(fā)現(xiàn)至少10種，參與凋亡的級聯(lián)反應，例如caspase-3，稱為CPP32/YAMA/apopain，可降解DNA修復有關的酶PARP［poly(ADP-ribose)聚合酶］。(2)細胞內(nèi)Ca2+增高，活化核酸內(nèi)切酶，切割染色體以核小體

59、DNA(約200 bp)為單位的DNA片段，此切割是非隨機的，它與壞死時DNA隨機降解有明顯的不同。(3)與胞漿蛋白質(zhì)交聯(lián)有關的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的增加。(4)細胞膜內(nèi)層的磷脂酰絲氨酸外翻至膜外，從而有利于巨噬細胞的識別和吞噬。,定量檢測細胞凋亡的方法,1.DNA片段化的定量。包括分離胞漿片段化DNA的定量和以流式細胞儀(FACS)分析細胞的亞二倍體峰。2.抗組蛋白抗體經(jīng)Elisa測定胞漿核小體。3.PARP的Western印跡法

60、測定凋亡的早期事件。113 000的PARP降解為89 000及24 000的片段，這是凋亡蛋白酶caspase-3/CPP 32的作用所致。4.膜聯(lián)蛋白-5(annexin-5)熒光法。以FACS直接分析凋亡與壞死，這是因膜內(nèi)的磷脂酰絲氨酸在凋亡時轉(zhuǎn)至膜外而被標記。5.原位細胞死亡測定(TdT-mediated dUTP-Xnick end labeling, TUNEL)。這是基于核酸內(nèi)切酶將DNA鏈切出缺口的原理。,（二）細胞

61、周期,細胞周期（細胞分裂周期），是指一個細胞經(jīng)生長、分裂而增殖成兩個所經(jīng)歷的全過程，G0=靜止期G1=可變的DNA合成前期， (12h~幾天)S=DNA合成期(2~4h)G2=DNA合成后期， (2~4h)M=分裂期(1~2h),,細胞周期特異性藥物是指那些僅對惡性腫瘤細胞增殖周期中．某一期細胞有殺滅作用的藥物。例如：羥基脲、阿糖胞苷、巰嘌呤、甲氨喋呤等，能干擾DNA的合成，對惡性腫瘤細胞的S(DNA合成)期有特異性殺傷作用；

62、長春新堿和長春花堿，則可特異地殺傷處于M(有絲分裂)期的細胞。,,細胞周期非特異性藥物是指對處于細胞增殖周期中的各期(G1、S、G2、M)或是休止期的細胞(G0)均具有殺滅作用的藥物。它們大多能與細胞中的DNA結(jié)合，阻斷其復制。從而表現(xiàn)其殺傷細胞的作用?？鼓[瘤藥物中的烷化劑及阿霉素、博萊霉素等抗癌抗生素即屬于此類藥物。,（三）端粒與腫瘤,端粒酶在正常體細胞中無活性或檢測不出其活性，而在大多數(shù)腫瘤細胞中活性高，且其功能是添加端粒重復序列至

63、DNA末端阻止端粒隨細胞分裂而縮短，起著穩(wěn)定DNA的作用。因此，許多學者推測端粒酶可能是腫瘤治療的最佳靶點之一。FENGJL等（1995），用端粒酶RNA組份的反義核苷酸轉(zhuǎn)導入HeLa細胞中后，細胞端粒酶活性喪失，端粒也隨著細胞分裂而逐漸變短，經(jīng)20－26個倍增時間，細胞發(fā)生衰老死亡。,1.端粒酶的生化特性,端粒酶：蛋白——起催化端粒合成的作用， RNA——作為端粒合成的內(nèi)模板端粒酶的功能即為添加端