高爾基體中糖基轉移酶的信號介導的動態(tài)保留

1、高爾基體中糖基轉移酶的信號介導的動態(tài)保留LinnaLinnaTuTuWilliamWilliamC.C.S.S.TaiTaiLuLuChenChenDavidDavidK.K.BanfieldBanfield?高爾基的糖基轉移酶是一種酶家族的有序的修改糖蛋白的具體方式蛋白。第二類組成，這些膜蛋白的特點是短期暴露細胞質氨基末端尾巴和一腔酶域。細胞質尾巴發(fā)揮本地化的糖基轉移酶的作用，外殼蛋白復合物COPI泡介導的逆行運輸也在高爾基內工作。然

2、而，這些酶缺乏的尾巴能識別COPI序列。在這里，我們發(fā)現(xiàn)Vps74p綁定到在多數(shù)的酵母細胞質尾巴五聚體主題目前高爾基本地化的糖基轉移酶，以及COPI。我們建議Vps74p保持穩(wěn)定，高爾基州的糖基轉移酶動態(tài)定位到COPI通過促進其納入小泡。在高爾基體的功能，作為新合成的蛋白質分揀中心和作為糖蛋白的翻譯后修飾的位置。蛋白糖基化是發(fā)起的內質網(wǎng)（ER）。糖蛋白，然后經(jīng)過由高爾基組本地化廣泛的順序糖基轉移酶糖鏈伸長和闡述介導的。雖然他們獨特的催化

3、糖基化反應，并顯示腦池的分布特點，高爾基居民糖基轉移酶都是II型膜蛋白組成的短期暴露細胞質N末端（尾）組成一個單獨得薄膜區(qū)，一個導向主干區(qū)域和催化結構域的腔。Avariety的功能已確定了影響這些酶（13）：在跨膜區(qū)（48），特定區(qū)的腔面向非催化區(qū)（68），催化域之間的相互作用（9，10）和細胞質尾（1113）。穩(wěn)態(tài)這些酶的分布狀態(tài)維持一個動態(tài)的過程，它涉及到從晚期高爾基到早期生理池的檢索，以及與高爾基和內質網(wǎng)，于是他們過境回到池對它們

4、的功能（14，15）。雖然糖基轉移酶的功能，直接的一個特定的酶一池或另一穩(wěn)態(tài)變化，大概外殼蛋白復合物（COPI），小泡是由其中這些酶大部分被回收（14，16的主要手段）。然而，高爾基居民糖基轉移酶缺乏規(guī)范COPI在其細胞質尾巴結合基序，我們設法查明的蛋白質，可以結合這些酶的尾巴，COPI可以促進其納入小泡。我們確定了一個基本與高爾基刪除相關的殺傷力居民圈套遺傳屏幕前部抑制Vps74p（水溶性N乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體），Sft

5、1p，高爾基內的（17）逆行運輸所需的一種蛋白質。Vps74p是一個蛋白質家族，其中包括哺乳動物蛋白GPP34（GmX33a）和GPP34R（GmX33b）（1821）的成員。雖然VPS74刪除了對酵母細胞生長無明顯影響，vps74D細胞已知非分類的羧肽酶Y，這說明Vps74p參與蛋白質的運輸（22）。我們注意到，vps74D缺陷細胞中的糖基（GPI）的處理錨定蛋白Gas1p。Gas1p是修改增加了N和O連接碳水化合物，因為它穿越途中的

6、高爾基體與細胞表面（圖1A）（23）。在酵母中的Gas1p缺乏N中所涉及的酶菌株命運的比較和Oglycosylation揭示了在缺乏的A12mannosyltransferase，Kre2p（圖1，A和B）（24）細胞類似的加工缺陷。我們考慮到Vps74p可能需要Gas1p運輸和審查功能Gas1p販運單體的可能性，紅色熒光蛋白（Gas1pmRFP）融合蛋白在細胞缺乏Vps74p（25）。然而，Gas1p位置在vps74D細胞mRFP是無

7、法區(qū)別的，在野生型細胞（圖1c）。像GPP34（18），Vps74p是一個外周膜蛋白（圖1，D和E），因此，只會有能力直接的物理與細胞質相互作用面向N端11個氨基酸的Kre2p。我們建造了一個混合體，其中蛋白質的Kre2p的細胞質和跨膜區(qū)域融合到N端該Anp1Kre2混合蛋白恢復Gas1p加工kre2D細胞（圖3a）的無力令人費解，因此我們認為有可能承認的Vps74pglycosyltransferas中，除了滑膜樣主題。最近的一項研究

8、表明，一個在Mnn9p回收二元序列從高爾基重要作用，內質網(wǎng)（13），和我們的酵母雙雜交化驗，Kre2p穩(wěn)定性研究和活細胞成像實驗的支持，為KR8肽要求在Vps74的Kre2p（圖四）依賴保留。此外，我們發(fā)現(xiàn)沒有滑膜樣內殘留的要求極樣Kre2p主題，而F4和L5，是必不可少的結合Vps74p（圖五）。因此，Vps74p關于酵母高爾基體結合位點，符合居民的糖基轉移酶的(FL)(LIV)XX(RK)的一個主題是在16高爾基居民酶的存在（見表1

9、）。為了測試這項建議的有效性，我們研究了Mnn5命運綠色熒光蛋白，其中包含一個序列，符合共識（LIXXK6）在vps74D細胞。與我們的預測，Mnn5綠色熒光蛋白相一致的是非局部化在這些細胞中（圖六）液泡流明。Vps74p可以促進或阻止從高爾基這些酶順販運或協(xié)助其通過高爾基回收池或從高爾基體到急診室，在這個過程通過COPI大衣（圖中一）糖基轉移酶介導高爾基保留。為了區(qū)分這些可能性，我們研究了Kre2CT命運綠色熒光蛋白在細胞中的組成性高

10、表達Vps74p。我們推斷，如果Vps74p運作在急診室回收途徑，表達的蛋白質可能將轉向穩(wěn)定的Kre2CT態(tài)分布，從高爾基體到內質網(wǎng)綠色熒光蛋白。這確實是如此VPS74表達了對穩(wěn)定的Kre2CT國家定位的影響，綠色熒光蛋白是不是因為在急診室塊或間接出口到逆行運輸一般加速度（圖三維）。Vps74p綠色熒光蛋白在Kre2CT的逆行運輸作用也得到了我們的基因研究。除了VPS74，我們還發(fā)現(xiàn)基因編碼的高爾基囊泡大衣復雜COPI或基板（圖七）組件

11、。由于Sft1p是在高爾基（17）逆行運輸需要，我們推測，作此sft1D細胞缺乏這些基因表達的補償。此外，觀察基因之間的相互作用和VPS74缺陷突變體在ER高爾基販賣（圖七）。鑒于Mnn9p復雜（16）和Kre2CT綠色熒光蛋白（圖中一）周期的電腦操作員之間的高爾基體和ER依賴性，我們認為有可能Vps74p可能功能的電腦操作員共同調解回收圖2。VPS74的刪除導致非局部化和高爾基一個子集糖基轉移酶的降解。（甲）Mnn2綠色熒光蛋白，Mn

12、n9綠色熒光蛋白，并Ktr6CT綠色熒光蛋白是vps74D細胞的非局部化。（乙）氨基酸的替換在Kre2胞質尾FLS6序列[kre2（AAA6）的CT綠色熒光蛋白]結果的蛋白質非局部化。（A和B）比例尺，5毫米。（丙）細胞表達作為其Kre2p的唯一來源kre2（AAA6）有缺陷的Gas1p處理。（?。﹌re2（AAA6）是不穩(wěn)定的vps74D細胞。（）或（）表示h后內切糖苷。在糖化（糖）和deglycosylated（去糖）的Kre2p形

13、式，見箭頭。有關的試劑和方法的詳細說明使用，見（24）。WT野生型。表1在酵母細胞質尾巴氨基酸序列高爾基居民糖基轉移酶（27）。滑膜樣在突出的斜體字中。糖基轉移酶軸承推定Vps74p結合，(FL)(LIV)XX(RK)主題突出顯示粗體和他們的相應的主題是強調和斜體字中。酶氨基酸序列的胞質尾Kre2MALFLSKRLLRKtr1MAKIMIPASKQPVYKKKtr2MQICKVFLTQVKKKtr3MSVHHKKKLMPKSALLIRK