第二章 免疫組織化學的基本理論與技術

1、第二章 免疫組織化學的基本理論與技術,一、免疫組織化學的基本理論1 原理：免疫組織化學(Immunohistochemistry) 是利用抗原與抗體特異性結合的原理，使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質)，對其進行定位、定性及定量的研究。 可在光鏡和電鏡水平觀察細胞膜及細胞內某種抗原物質的存在，從而為研究生命大分子，特別是酶、蛋白質、激素及受體蛋白等在組織內分布、細

2、胞內定位以及代謝狀態(tài)等，提供了特異性強、靈敏度高而又直觀化的原位分析細胞組成物質的手段。,2 免疫組織化學全過程包括: ⑴ 抗原提取⑵ 抗體制備 (博士德,華美,基因公司等購買)⑶ 抗體標記⑷ 免疫染色⑸ 觀察分析等過程,二、抗原與抗體,1.抗原 Ag 定義：是指能刺激機體產生免疫應答，并與相應的免疫產物（抗體）發(fā)生特異性結合的物質。 蛋白質：免疫原性最強； 多糖：免疫原性次之； 脂類和核酸：必需

3、和蛋白質及多糖形成復合物才具有良好的免疫原性。,2.抗體 Ab 定義：是機體受到抗原刺激后，由免疫細胞合成并分泌出 一類具有與抗原發(fā)生特異性結合的球蛋白。 存在部位：主要存在于血清內。 分類：根據(jù)重鏈的結構及抗原特異性不同分為五種， 即IgG、 IgD、IgE、IgA、IgM。 根據(jù)制備方法不同分為兩種 即單克隆抗體與多克隆抗體,IgG的結構,IgG分

4、子呈“Y”型由兩條L鏈和兩條H鏈組成。用木瓜酶水解IgG可得到3個片段：兩個相同F(xiàn)ab段或抗原結合段和另一Fc段或可結晶段。在Fab段與Fc段之間有一個對酶敏感的區(qū)域，稱鉸鏈區(qū)。,多克隆抗體,制備原理：將純化的抗原注射入動物體內時，一系列抗體生成細胞會不同程度的與抗原結合，受抗原刺激后在血液中產生不同類型的抗體，這種由一種抗原刺激產生的抗體稱為多克隆抗體。,單克隆抗體,Ag,合成抗體,,效應性B 細胞(漿細胞),不能在體外生長,瑞士

5、Kohler,英國Milstein,多發(fā)性骨髓瘤細胞,多發(fā)性骨髓瘤細胞,,不能合成抗體,能在體外大量繁殖,,,脾,多發(fā)性骨髓瘤細胞,,,,,,,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,Ab,,一抗,,單克隆抗體,多克隆抗體,,,缺點:價格較高，容易出現(xiàn)假陰性反應。,實質:是受同一種抗原刺激，由多個B淋 巴細胞克隆所產生的抗體混合物。,優(yōu)點:容易制備，價格便宜,缺點:可能與多種

6、特異性和非特異性的抗原決定簇反應，出現(xiàn)非特異性染色，影響結果的判定。,實質:是受同一種抗原刺激，由單個B淋 巴細胞克隆所分泌的抗體。,優(yōu)點:特異性強，敏感性高，抗體產量高。,首選,三、免疫組織化學的基本技術,免疫組織化學技術是用標記物或顯色物標記的抗原(或抗體)檢測組織和細胞內的抗原，從而達到診斷或研究的目的。特定抗原(或抗體)的顯示和定位是否準確與細胞和組織標本制各的質量好壞有著密切關系。因此，組織和細胞標本的取材和制備至關重要

7、。,1.組織標本制備（1）標本新鮮：一般在2h以內進行。（2）取材部位：取含待檢抗原部位，還應取病灶與正常交界處，即抗原陽性和陰性區(qū)，必要時取遠離病變區(qū)的正常組織作為對照。對于只研究正常組織抗原，取材時應盡可能避開壞死區(qū)。（3）避免擠壓：剪刀、刀片的刃口要鋒利。（4）取材大小：做石蠟切片的組織厚度不宜超過2mm，用作冰凍切片的以4mm為宜。（5）固定:化學固定,或于液氮中,或－70℃冰箱中保存。,2．細胞標本制備,(1)印片

8、法應用：活檢標本、手術切除的標本。方法：將新鮮標本暴露病區(qū),用載玻片輕壓病區(qū)，脫落細胞粘附于載玻片上，立即浸入固定液中5-10min，取出后自然干燥，低溫保存。優(yōu)點：簡便省時，細胞抗原保存較好。缺點：細胞分布不均、重疊,影響觀察效果,(2) 穿刺吸取涂片法 應用：實質器官的病變區(qū)。 方法：①穿刺液較少時直接涂片,力求均勻。 ②穿刺液較多時，穿刺液滴入2毫升 Hanks液內，離心，

9、制成細胞懸 液，吸一滴于載玻片上，輕涂， 干燥后固定。 優(yōu)點：細胞均勻。 缺點：細胞易變形。,(3)體液沉淀涂片法 1) 細胞數(shù)較多，取一滴直接涂片。 2) 細胞數(shù)較少時，取5毫升自然沉淀液以1500rpm離心10min，棄上清，將沉淀涂片，略干后固定備用。,（4）體外培養(yǎng)細胞 1)貼壁生長的細胞：將蓋玻片插入培養(yǎng)液中，讓細胞自然貼壁于蓋玻片上。 2)懸浮生

10、長的細胞：可用離心涂片機法制成涂片。 （5）離心涂片機法 制成2×105-6／ml細胞懸液,取50～100μl，加入涂片機內，1000r／min, 2min，細胞即可均勻分布于載玻片上。,（二）免疫組織化學的固定方法,免疫組織化學固定的原則：最好地保存細胞和組織的形態(tài)結構和最大限度地保存抗原的免疫活性。方法：一）固定有物理固定，如血涂片可采用空 氣快速干燥、凍結干燥等；二）化學固定,1．浸入法： 組織

11、立即浸于固定液內,時間在2～12h之間。2．灌注法： 插管由左心室插入主動脈,先用PBS沖洗血液,再 以泵或吊瓶灌注固定液。在灌注后30min內取材, 再置同一固定液內浸入固定l～3h?？墒构潭ㄒ?到達全身各處組織。3．微波固定： 微波處理后,溫度升高,分子運動加快,促進固定 液向組織內滲透,短時間達到固定效果。將標本 放入5～10ml固定液內,置于爐中央,周邊放一燒 杯盛400純水以

12、吸收爐內產生的熱量,選擇強檔照 射10～30s,照后固定液溫度≤50℃。取出后,在 相同固定液內再固定2～6h(室溫)。,（三）重要固定液,(1) 醛類固定劑: 為雙功能交聯(lián)劑, 可使組織間相互交聯(lián)，將抗原保存于原位。特點是對組織的穿透性強，收縮性小.是常用固定劑。1) 10％中性緩沖福爾馬林：該固定劑易使組織硬化而致浸蠟困難，因此固定時間不宜過長。2) 4％多聚甲醛磷酸緩沖液：適應性較廣泛，因較溫和，適于組織標本的較長

13、時期的保存。3) Bouin's液：對組織固定力強且較均勻。比單獨醛類固定更適和免疫組化染色，較常用，通常4℃下固定6～8h。4) Zamboni液：用于光、電鏡免疫細胞化學觀察。,(2) 非醛類固定劑： 為非醛類雙功能試劑，單獨應用時，邊緣固定效應較重，但與戊二醛或多聚甲醛混合使用時，效果明顯好轉。較適用于多肽類激素的組織固定。1) 碳化二亞胺液: 適用于含多肽激素組織的固定。2) 碳二亞酰胺一戊二醛液(ECD—G

14、液)：對酶等蛋白質固定效果良好，對細胞內抗原定位，超微結構保存好，是培養(yǎng)細胞電鏡免疫細胞化學的良好固定劑，也常用于多肽類激素固定。3) Zenker’s液：因含重金屬，固定時間要短，以2～4h為宜。染色前必須脫汞。,(3) 丙酮及醇類固定劑： 其作用是沉淀蛋白質和糖，對組織穿透性很強，能夠較好地保存抗原的免疫活性。但醇類對低分子蛋白、多肽及胞漿蛋白質的保存效果較差。與冰醋酸、氯仿、甲醛等混合使用，效果可明顯改善。1) 丙酮：

15、常用于冰凍切片及細胞涂片的后固定。保存抗原性較好，穿透性及脫水性較強。2) 95%乙醇：用于冰凍切片及細胞涂片的后固定。效果較差,和其他試劑混合使用,染色較好。3) AAF液：較常用的固定液。(95～100％乙醇85ml，冰醋酸5ml，濃甲醛10m1)。 4) Carnoy液：100％乙醇醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4℃保存?zhèn)溆谩?3．固定劑的選擇 固定劑的種類很多，至今尚無統(tǒng)一標準的固定劑，10％中

16、性甲醛是國際最通用的固定劑。需指出，同一固定液固定的組織，染色結果可截然不同；不同的抗原和不同的組織標本往往需反復試驗，必要時可做多種固定液對比，才能選出最佳的固定液。,(四) 組織包埋和切片技術,固定的和未經固定的組織、細胞以及各種涂片和切片方法均可用于免疫組化，但其效果不同。光鏡免疫組織化學的切片厚度一般為4～6μm，而神經組織切片通常為20～100μm厚，以便顯示神經纖維的走行。,1．冰凍切片 冰凍切片(frozen se

17、ction)是酶組織化學和免疫組織化學染色中最常用的一種切片方法。 優(yōu)點：1）能較好地保持抗原活性(尤其是表面 抗原)和酶的活性。 2）冰凍切片簡便快速，省去固定、包埋 和切片處理等一系列繁瑣步驟。 適用范圍：新鮮的組織及已固定的組織均可作 冰凍切片。 缺點：1）不能用于回顧性研究。 2）不利于常規(guī)檢查和長期保存標本。

18、 3）不如石蠟切片結構清晰。,（1）冷凍、包埋 為防止冷凍中形成冰晶破壞組織結構和保持抗原，采?。?) 浸入深低溫預冷的（干冰容器內，-70℃)正已烷液內驟冷30～60秒，或用OCT包埋劑浸透，使組織速凍，溫度驟降，減少冰晶的形成。方法：①干冰-丙酮法： ②液氮法：2) 將固定后或未固定的組織置于20％-30％蔗糖溶液l～3天。利用高滲吸收中水份;減少組織含水量。包埋、冷凍步驟同上。,(2) 切片

19、 技術難度較大，選擇好的冰凍切片機是保證切片質量的關鍵。 1) 恒冷箱切片機(cryostat)—常用、理想的切片機： 切片機置于-30℃低溫密閉室內，可連續(xù)切薄片．切片時，低溫室內溫度以-15～-18℃為宜，溫度過低組織易破碎。 2) 開放式冰凍切片機：切片時暴露空氣中，切片技術難度大。在高溫季節(jié)，切片更加困難，目前處于淘汰階段。,(3) 冰凍切片的保存使用 如不染色，必須室溫下吹干30min以上，裝入

20、密封的標本盒內，外包塑料袋，置于-20℃低溫冰箱，一個月內使用。 染色前，從冰箱內取出切片，置室溫干燥10min，再經丙酮固定5～10min(未固定者)，即可進入染色程序。,2. 石蠟切片 石蠟切片(paraffin secfion)：指在切片前，固定的組織塊需經乙醇逐級脫水，二甲苯透明，再浸蠟包埋。 組織在浸蠟、包埋時，石蠟溫度應低于60℃，各步驟時間均不宜過長(1～2h)，以免組織變脆。

21、切片一般厚約3～5μm，切片于37℃烘烤過夜，可置4℃保存，脫水、透明也可在4℃進行。（詳見組織學與胚胎學第六版）,3．振動切片 振動切片是將新鮮組織(不固定不冷凍，或低濃度固定液稍稍固定)后用振動切片機切成20～100μm厚，漂浮免疫組化染色，檢出陽性部位，后固定，常規(guī)電鏡樣品制備。適于免疫電鏡細胞化學觀察。,4． 塑料包埋切片(plastic section) 常用的包埋材料有兩大類：甲基丙烯酸鹽類和環(huán)氧樹脂

22、類。 前者能較好地保存抗原，不與組織產生共聚合，染色前不必脫去包埋材料，但形態(tài)結構欠佳，切片易皺折； 后者能較好地保持形態(tài)結構，但在聚合過程中易與組織作用，改變抗原結構。 優(yōu)點：組織塊可同時用于一般光鏡切片、半薄切片(0.5～1.5μm)和電鏡超薄切片。 缺點：所經步驟繁瑣，抗原活性易喪失。 應用范圍：塑料包埋切片主要用于免疫電鏡超薄切片前定位。,5. 超薄切片 超薄切片(ultrathin section

23、)適用于免疫電鏡細胞化學，需用超薄切片機(詳見有關電鏡技術資料)。6．載玻片及蓋玻片的處理和切片的附貼(1)載玻片及蓋玻片的處理 1)載玻片：清洗液(酸)浸泡12-24h，水洗，95％乙醇浸泡2h后擦干或烤干。 2)蓋玻片：清洗液浸泡2h，或鹽酸乙醇浸泡后水洗，95％乙醇浸泡，擦干。,(2) 切片的附貼 為防止染色過程脫片，適用免疫組化染色中的附貼劑：1)甘油．明膠；2)甲醛一明膠；3）鉻明礬-明膠；4）多聚賴

24、氨酸(Poly-L-Lysine)；5）APES；6）APES和Poly-L-lysine聯(lián)合應用：適于特別容易脫片的情況。,（五）免疫組織化學的染色方法及注意事項,一）免疫組織化學染色方法1.按標記物種類分為： 免疫酶法； 免疫金一銀法； 鐵標記法； 免疫熒光法； 雙重或多重免疫染色法等。,2. 按標記抗體不同分為: （1）直接法： 抗原 + 一抗（標記物標記） 鏡下觀察

25、 優(yōu)點：簡單，時間短，特異性強。 缺點：靈敏度差，所需抗體量大，不經濟，淘汰。,（2） 間接法：經過二次抗體抗原 + 一抗 + 二抗（標記物標記） 特點：較直接法靈敏，可標記一種抗體→鑒定多種抗原。,（3） 非標記抗體橋法（橋連法、多步法） 經過三次抗體特點：任何抗體均未被酶標記； 酶是與抗酶 抗體結合，避免因共價結

26、合對抗體和酶活性的影響，提高敏感性，節(jié)約一抗用量。 抗標記物抗體（用與一抗同種動物產生） 抗標記物抗體 + 標記物 = 免疫復合物(如PAP，APAAP), 抗原 + 一抗 + 二抗 + 三抗 （PAP，APAAP）,1）單橋法抗原 + 一抗 + 二抗（橋抗體）+ 三抗（抗酶抗體）底物顯色,2） 雙橋法 在三抗之后，將二抗和三抗再重復一次，可增大染色強度。 ★ 特別提示：注意動物種屬關

27、系的一致性。 （4）葡萄球菌A蛋白法（5）ABC法、SABC、Envision…,2 免疫組化染色基本技術,（1）抗體稀釋度 1）工作液--- 2） 原液--- 預實驗 3） 抗體濃度選擇---- 控制一定濃度范圍 （2）抗體滴片技術 （3）PBS洗滌 1）目的----- 保證離子濃度、PH、減少

28、非特異反應 2）方法,（3）抗體孵育技術 濕盒、溫度、時間,二）免疫組化染色注意事項：① pH： 中性及弱堿性 反應液和洗滌液： pH 7.2-7.4緩沖液配制② 離子濃度： 低離子濃度： 0.01-0.02mol／L緩沖液③ 去污劑： 0.05％Tween20 0.01% EDTA 0.1％-l％Triton

29、X-100 可分別加入反應液和染色前洗滌液內,④ 抗體稀釋液中蛋白質濃度： 減少抗體的非特異性吸附 0.1-0.6％牛血清白蛋白(BSA) 5-10％正常山羊血清 ⑤ 防腐劑： NaN3(0.0l％)---抑制非特異性著色、提高靈敏性 ⑥ 溫度和時間： ⑦ 濕度 ⑧ 洗滌： 可除去前一步所加的未結合抗原或抗體，以消除因非特異性染色。 洗滌液中可加入

30、去污劑 振蕩,（六）對照,目的：證明和肯定陽性結果的特異性。 主要是針對第一抗體對照，常用的對照方法包括： ① 陽性對照； ② 陰性對照； ③ 阻斷試驗； ④ 替代對照； ⑤ 空白對照； ⑥ 自身對照； ⑦ 吸收試驗。,(一)陽性對照 已知抗原陽性的切片-----陽性對照 待檢標本呈陰性結果時，陽性對照尤為重要。(二)陰性對照 不含已知抗原的標本----陰性對照

31、 空白、替代、吸收和抑制試驗都屬陰性對照 待檢標本呈陽性結果時，陰性對照就更加重要，用以排除假陽性。,準確判斷陽性和陰性,排除假陽性和假陰性結果對照實驗多次重復實驗幾種方法進行驗證,（七）免疫細胞化學結果的判斷,特異性染色與非特異性染色的鑒別點 特異性染色表現(xiàn)： 常分布于特定的部位, 即具有結構性。 在同一切片上呈現(xiàn)不同程度的陽性染色結果。 非特異性染

32、色表現(xiàn)： 無一定的分布規(guī)律,常為成片的均勻著色； 細胞和周圍的結締組織均無區(qū)別的著色,或CT呈現(xiàn)強染； 切片的邊緣、刀痕、組織折疊部位易出現(xiàn)。非特異性和特異性染色同時存在： 過強的非特異性染色背景,1陽性細胞的染色特征(1)陽性細胞染色分布為灶性和彌漫性，三種類型： ① 胞漿：大部分抗原見于細胞漿 ② 細胞核 ③ 細胞膜表面 (2)細胞內含抗原量不同

33、 染色強度不一(3）陽性細胞與陰性細胞相互交雜分布;(4)相同的陽性染色強度,不能用于判斷陽性。 如：切片邊緣、刀痕、皺折區(qū)； 壞死或擠壓的細胞區(qū)； 結締組織等,,,結 束,,,2） 雙橋法 在三抗之后，將二抗和三抗再重復一次，可增大染色強度?！?特別提示：注意動物種屬關系的一致性。 （4） PAP法（過氧化物酶－抗過氧化物酶法Peroxidase anti-peroxida

34、se method, PAP法） PAP法是橋法的改良，基本原理與橋法相同，只是酶（HRP）和抗酶抗體先制成免疫復合物（PAPcomplex），既抗原－抗體－抗IgG抗體－PAP復合物，代替橋法中的抗酶抗體和隨后與酶結合，把兩個步驟合并為一步。 該法簡化了操作步驟，提高了靈敏度，所染標本可長期保存。,（5） ABC法（親和素－生物素－過氧化物酶復合物法，Avidin-biotin-peroxidase Complex meth

35、od，ABC法）Avidin: 親和素，一種糖蛋白，其上有四個與生物素相結合的位點。Biotin：生物素－維生素H，兩者親和力巨大，牢不可破。ABC法與PAP法的區(qū)別是：以ABC復合物代替PAP復合物。 1）ABC復合物的制備：,2）ABC法反應原理,（6）SP或SAP法（過氧化物酶標記的鏈霉卵白 素或過氧化物酶標記的堿性磷酸酶染色 Streptavidin/peroxidase or strep