蛋白電泳在腎臟疾病診斷中的臨床應用

1、蛋白電泳在腎臟疾病中的臨床應用,主講人：喬玉龍 2014年7月21日,北京康圣安科技發(fā)展有限公司,1,第一部分-為什么要做尿蛋白電泳？第二部分-多發(fā)性骨髓瘤腎臟損傷?第三部分-能診斷哪些腎臟疾病?第四部分-臨床符合率怎樣？如何看電泳結果？,2,內(nèi)容提綱,腎臟病基本診斷思路,第一步：是不是腎臟??？第二步：是腎小球疾病,還是腎小管疾??？ 有條件的要確定病理類型第三步：是哪種綜合征？第四步：是何種原

2、發(fā)性疾病，腎功能是否正常？,第一步：如何判斷是不是腎臟病 ？,1.血尿、水腫、腰痛、多尿、尿頻等是腎臟疾病常見的癥狀。但上述癥狀并不能說明腎臟有病。2.以上臨床癥狀+尿常規(guī)異常（蛋白尿、血尿、管型尿,白細胞尿)3.以上臨床癥狀+腎功能異常。 以上2、3中任何一項才能考慮為腎臟病。,腎小球疾病,原發(fā)性腎小球疾病1.急性腎炎2.慢性腎炎3.IgA腎病繼發(fā)性腎小球疾病1.腎病綜合癥2.糖尿病腎病3.狼倉性腎炎4.

3、腎小球沉積病1）淀粉樣變性 2）輕鏈沉積病3) 巨球蛋白血癥4）冷球蛋白血癥腫瘤相關性腎小球疾病,間質性腎炎-TIN,原發(fā)性間質性腎炎：腎臟損傷主要位于腎小管和間質，無明顯的腎小球和腎血管系統(tǒng)病變繼發(fā)性間質性腎炎：腎小球和和腎血管系統(tǒng)疾病引起的小管和間質損傷TIN是引起腎功能衰竭的重要疾病臨床表現(xiàn)：急性TIN：表現(xiàn)為少尿性或非少尿性急性腎損傷，通常腎小管會損傷。特發(fā)性急性TIN：多見于青年女性，臨床表現(xiàn)為疲乏，發(fā)

4、熱，肌肉疼痛或眼部葡萄炎等。伴有腎小管損傷征象。實驗室檢查可有貧血，嗜酸細胞增多，血沉快，CRP及Y球蛋白升高。,腎性糖尿病腎性氨基酸尿腎小管性酸中毒范科尼綜合癥,腎小管疾病,北京康圣安科技發(fā)展有限公司,7,尿,尿,量,質,尿 閉 ﹙ ≈0 ml∕day﹚無 尿 ﹙ 2500 ml∕day﹚,有形成份﹙細胞、管型、結晶﹚無形成份,,蛋白尿尿 糖尿中肌酐、尿素氮、尿酸等,尿的測定,早期腎病診斷大多依靠尿蛋白含量

5、做出大概的分類.隨著腎小球基底膜損害不斷加重,尿中排泄的蛋白量不斷增加,然而終末期腎衰患者腎小球多數(shù)已毀壞,尿量反而減少,說明尿蛋白含量的多少不一定能完全反映腎臟損傷的程度.☆實驗發(fā)現(xiàn)尿蛋白含量與腎臟損傷程度并不呈正比.常規(guī)尿蛋白定量嚴重低估了腎臟損傷的程度,并且無法明確鑒別腎臟損傷部位.尿蛋白電泳作為腎臟疾病的早期診斷方法越來越受到重視.其有助于確定尿蛋白來源,對尿蛋白組分進行精確分析,有助于疾病的診斷和預后的判斷,為臨床提供

6、極有價值的證據(jù).,蛋白尿,9,10-40%的MM確診時 已出現(xiàn)腎損害25%-50%的MM在病程中出現(xiàn)程度不同的腎功能異常腎損害類型管型腎病-骨髓瘤腎?。–N）-最常見（腎小管損害）淀粉樣變性免疫球蛋白沉積?。∕IDD）,骨髓瘤腎臟損害,10,腎臟疾病的病因機制,腎功能衰竭,穿刺部位,腎穿禁忌癥,出凝血異常孤立腎一般情況差小腎其他過度肥胖、重度腹水、配合欠佳,合并癥及其處理,出血大出血血腫血尿感染動靜瘺上

7、海新華醫(yī)院 – 中華醫(yī)學會檢驗學會副主席-沈霞教授總結: 腎活檢雖然對腎臟疾病的病理及免疫分型具有很高的診斷性,但由于腎穿刺屬于創(chuàng)傷性診斷技術,可能造成出血,感染等并發(fā)癥,而且穿刺技術及取材部位也會影響穿刺的成敗,因此患者對此顧慮較大.,合并癥及其處理,出血大出血血腫血尿感染動靜瘺上海新華醫(yī)院 – 中華醫(yī)學會檢驗學會副主席-沈霞教授總結: 腎活檢雖然對腎臟疾病的病理及免疫分型具有很高的診斷性,但由于腎穿刺屬于創(chuàng)傷性診斷技

8、術,可能造成出血,感染等并發(fā)癥,而且穿刺技術及取材部位也會影響穿刺的成敗,因此患者對此顧慮較大.,解放軍總醫(yī)院-腎內(nèi)科-陳香美院士,迄今為止，各類腎病的臨床診斷與病情的進展判斷主要依賴于腎活檢，其次為尿蛋白，血液生化等檢測指標。腎活檢的創(chuàng)傷性使其難以隨時施行，而臨床的血液生化指標又難以早期，全面地反映疾病的病理改變。因此，國外及國內(nèi)多數(shù)專家學者，試圖通過蛋白組學研究方法找到與腎臟疾病相關的特殊蛋白質標志物，以用于早期診斷與療效的隨訪

9、觀察。蛋白電泳是尿液蛋白質組學研究中分離和鑒定的常用方法。 摘自: 單位：北京解放軍301醫(yī)院-腎內(nèi)科-陳香美院士,,17,腎小球損傷的-尿蛋白譜,腎小球性腎炎病理因素(感染)糖尿病腎病自身免疫性疾病腫瘤,與腎小球蛋白尿相關的疾病,北京康圣安科技發(fā)展有限公司,18,19,20,腎盂腎炎腎血管性疾病遺傳病:范科尼綜合癥腎毒性物質:重金屬(鉛,鈣)藥物性腎病:抗癌藥,慶大霉素等,與腎小管蛋白尿相關的疾病,北京康圣安科

10、技發(fā)展有限公司,21,22,23,a2-巨球蛋白 (900 kDa),,,,,SDS,,SDS,,+,,-,,,分子篩,原理：分子量排列,SDS：十二烷基磺酸鈉,25,SDS 尿蛋白 圖譜,電泳技術由于操作方便, 成本低廉, 目前已成為許多實驗室進行體液(血清, 尿液, 腦脊液…)分離、分析的常規(guī)方法之一 蛋白電泳是一項用途廣泛的檢測技術, 可用于多種疾病的檢測 (肝硬化, 腎病綜合癥, 多發(fā)性硬化癥, 血紅蛋白病, 單克隆免

11、疫球蛋白疾病…） 目前, 尚沒有一種方法可以取代電泳技術用于檢測多發(fā)性骨髓瘤中出現(xiàn)的單克隆免疫球蛋白(M蛋白) 電泳結果中對電泳圖譜的分析很重要，是唯一具有病理診斷價值的檢驗項目。,第二部分. 為什么會誤診與漏診？如何避免？,2.多發(fā)性骨髓瘤(Multiple Myeloma MM),河北省第三人民醫(yī)院 1557例

12、多發(fā)性骨髓瘤誤診分析,呂鴻雁, 張金巧. 河北醫(yī)藥. 2009, 31(9): 1052-54,誤診率：65.17%,重視實驗診斷,39.8%,15.6%,19.8%,7.6%,15.6%,就診晚 2/3 確診時已達中晚期 誤診率高 1/3 非血液科首診 >60%,多發(fā)性骨髓瘤診治現(xiàn)狀,晚骨折預后差增加負擔感染發(fā)生率高腎臟病變不可逆,,死亡率 ↑↑,華西醫(yī)院對-多發(fā)性骨髓瘤的誤診原因分析,MM缺乏特異性,首發(fā)癥狀

13、多種多樣。骨痛常為早期癥狀,骨質疏松或骨質破壞后,極易造成病理性骨折,誤診為骨科疾病☆發(fā)現(xiàn)尿蛋白或尿素氮升高,而被誤診為腎臟疾病因面色蒼白、乏力、納差、頭暈等貧血癥狀常被誤診為貧血;,診治現(xiàn)狀分析：北大人民醫(yī)院 - 血液病研究所 -黃曉軍（全國主任委員）,診斷及預后評估體系欠廣泛應用是影響MM規(guī)范化治療的原因之一。規(guī)范化治療源于正確的診斷。MM的診斷必須進行血和尿的免疫固定電泳以及24小時尿的蛋白電泳檢測。目前仍有很

14、多單位無法進行免疫固定電泳檢測，以北京25家三級甲等醫(yī)院調查為例：14家醫(yī)院不能進行免疫固定電泳檢測，基本上所有醫(yī)院均不常規(guī)進行尿蛋白電泳的檢測。摘自-《中華血液學雜志2013年4月第34卷第4期》,sebia,31,診治現(xiàn)狀分析：天津血液病研究所-邱錄貴,漏診與誤診原因分析1.目前初次就診的MM患者漏診和誤診率仍然很高，主要原因是：非血液科醫(yī)師：對本病缺乏認識 血液科醫(yī)師： 對診斷標準掌握不準2.骨髓穿刺的局限性

15、由于MM細胞在骨髓內(nèi)分布不均，可能會導致某些部位的骨髓穿刺結果低于上述數(shù)值，使得部分患者漏診MM早期瘤細胞散在分布于造血細胞和脂肪細胞之間，骨髓穿不易抽取到瘤細胞。瘤細胞分泌M蛋白，具有較正常有核細胞更強的骨髓基質粘附性，細胞越幼稚，粘附力越強，容易出現(xiàn)空抽。(華西醫(yī)院-血液科）3.現(xiàn)有參考標準過時舊的診斷標準（2003年前）不利于寡分泌型和不分泌型MM的診斷國內(nèi)目前多數(shù)教科書及血液科醫(yī)師廣泛參考的《血液病診斷及療效標準》（第

16、3版）MM的診斷仍然沿用以往的診斷標準，需要及時更新。摘自-《中華血液學雜志2013年4月第34卷第4期》,32,多發(fā)性骨髓瘤分型,,,多發(fā)性骨髓瘤分型,單克?。?0種）Ig G,IgA, Ig M,IgD, Ig E, (kappa，lambda),輕鏈型（2種） kappa，lambda,雙克隆型,不分泌型,14種,多發(fā)性骨髓瘤臨床表現(xiàn)/并發(fā)癥,,Calcium,Renal,Anemia,Bone,CRAB,起因：主要與

17、單克隆輕鏈造成的腎臟損害有關，病理學上可以表現(xiàn)為3種：管型腎病-骨髓瘤腎病淀粉樣變性輕鏈沉積病或混合型血清肌酐及GFR-主要針對腎小球 不同類型的M蛋白造成腎功能損害的概率不同IgG骨髓瘤-本周陽性率 60%IgA骨髓瘤-本周陽性率 71%IgD骨髓瘤-本周陽性率 100%,多發(fā)性骨髓瘤-腎功能不全,36,,,多發(fā)性骨髓瘤最新診治指南-診斷部分解讀 （2013版）

18、 上海長征醫(yī)院-侯健,2013診治指南-診斷部分更新內(nèi)容注重概念的深化強調骨髓瘤的診斷要認識疾病的本質，即導致相關靶器官的損害，出現(xiàn)典型的CRAB癥狀及免疫力低下所導致的反復感染，高滯血癥等。同時又要重視瘤細胞的生物學特征及對療效和預后的影響。注重把握新的診斷技術的應用首次列入并明晰了診斷骨髓瘤的必須檢測項目及對診斷或判斷預后有價值的項目，必須檢測項目是診斷骨髓瘤最為基

19、本而不可或缺的內(nèi)容。注重把握新標準的界定：在診斷標準上提出了新的診斷定義：在有癥狀骨髓瘤的診斷標準中不再強調M蛋白的數(shù)值，只要有血清和（或）尿中出現(xiàn)單克隆M蛋白，即為標準之一，但仍要求骨髓單克隆漿細胞比列≥10%。少數(shù)小于10%，若能證實CRAB癥狀由克隆性漿細胞引起，也可診斷。摘自《中華內(nèi)科雜志-2013年9月第52卷第9期》,北京康圣安科技發(fā)展有限公司,38,《2013版-多發(fā)性骨髓瘤診療指南》

20、 多發(fā)性骨髓瘤必需檢測項目,多發(fā)性骨髓瘤-國際診斷標準流程,,,,,第三部分-能診斷哪些腎臟疾病?,1.血清蛋白電泳2.血-免疫固定電泳3.尿-免疫固定電泳4.尿蛋白電泳,1.確定尿蛋白類型(見59-61頁幻燈）2.早期糖尿病腎病的診斷早期表現(xiàn):微量尿蛋白陽性糖尿病腎病電泳圖譜特征:以大分子蛋白為主, 腎損傷以腎小球為主,腎小管損傷較輕. 3.早期高血壓腎病的診斷電泳圖

21、譜特征:以小分子蛋白如a1-微球蛋白為主，腎損傷以腎小管為主，腎小球損傷較輕尿蛋白以腎小管性，混合型蛋白尿為主，對腎臟損傷較重,臨床應用范圍-北京天壇醫(yī)院-康熙雄教授,42,4.慢性腎炎，腎病 慢性腎炎，腎病為混合型蛋白尿，以腎小球性蛋白尿為主，若腎小管性蛋白尿增多時，表明預后不良。 5.腎功能不全尿中檢出的腎小管蛋白種類越多，腎功能惡化程度越嚴重.腎小管間質損害對腎小球腎炎患者的預后有著重要的影響。慢性腎功能不全患

22、者中，腎小球腎炎引起的最為常見,約占50%-60%，發(fā)展到腎功能不全時，尿蛋白電泳結果為混合性蛋白尿，各小管蛋白種類也增多，約在3種左右。6.尿免疫固定-尿游離輕鏈-多發(fā)性骨髓瘤,臨床診斷疾病,43,濾紙電泳醋酸纖維素薄膜電泳凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳—臨床聚丙烯酰胺凝膠電泳—科研毛細管電泳電泳技術的革命,蛋白電泳技術的變遷,電泳技術的原理,-,+,蛋白加樣位置,陰極,陽極,0,+,,正常血清,單克隆 Ig,1.血清蛋白電泳,

23、血清蛋白電泳是檢測M蛋白的唯一方法,若在?區(qū)出現(xiàn)異常的峰，且高寬比大于2:1,可以初步判定為M蛋白峰,正常血清蛋白電泳圖譜,血清蛋白電泳：M蛋白形成異常濃集帶，位于γ 區(qū)內(nèi)，或β 、α2 區(qū)內(nèi)可見一窄底的高峰。由于尿液可以濃縮許多倍，因此檢查游離輕鏈時尿蛋白電泳（UPEP）比SPEP靈敏。80%的MM患者可發(fā)現(xiàn)M蛋白,,,,血M蛋白鑒定,急性腎炎,特征：以急性腎炎綜合征為主要臨床表現(xiàn)的腎臟疾病：血尿，蛋白尿，水腫，高血壓臨床表現(xiàn)：本

24、病主要發(fā)生于兒童，高峰年齡為2-6歲，2歲以下或40歲以上的患者僅占所有患者15%。病理檢查：病理免疫熒光檢查可見：免疫復合物沉積，主要是IgG和C3，IgA和IgM較少見電鏡檢查可見上皮細胞下“駝峰狀”電子致密物沉積。,實驗室檢查,尿液檢查：幾乎所有患者都有鏡下血尿或肉眼血尿。尿中紅細胞多為畸形紅細胞。尿沉渣可見白細胞，小管上皮細胞，并可有紅細胞管型，顆粒管型。血常規(guī)：可由輕度貧血，白細胞計數(shù)可正?；蛏?，血沉加快。免疫學檢

25、查： 動態(tài)觀察C3的變化對診斷急性腎炎非常重要。疾病早期，C3下降，8周內(nèi)恢復到正常水平，是急性腎炎的重要特征。,電泳圖譜---急性炎癥,P N,,,,慢性腎炎,臨床表現(xiàn)：以血尿，蛋白尿，水腫和高血壓為基本癥狀。發(fā)病機制：主要與原發(fā)病的免疫炎癥損傷有關實驗室檢查：疾病早期尿液檢查可表現(xiàn)為程度不等的蛋白尿或血尿，可見紅細胞管型，部分患者出現(xiàn)大量蛋白尿，定量結果大于3.5g/24h.,電泳圖譜---慢性炎癥,,,

26、①高蛋白尿 ②高度水腫 ③高脂血癥 ④低白蛋白血癥,,三高一低,腎病綜合征是腎小球疾病中一種常見的臨床綜合征,,微小病變性腎病系膜增生性腎小球腎炎局灶節(jié)段性腎小球硬化癥膜　性　腎　病膜增生性腎小球腎炎,,,原發(fā)性,,系統(tǒng)性紅斑狼瘡 糖尿病過敏性紫癜乙型肝炎多發(fā)性骨髓瘤,原發(fā)性,繼發(fā)性,,膽固醇三酰甘油,總蛋白白蛋白< 30g/L,尿液檢查,血液學檢查,,,,白蛋白α1、?球蛋白α2、?球蛋白,

27、,,血脂,血漿蛋白電泳,血漿蛋白,,,,,,,,,,N P,總蛋白濃度降低(低于 60g/l),,電泳圖譜---腎病綜合征,,,,,M蛋白？什么類型？,2. 血清免疫固定電泳,G A M kappa lambda,血清免疫固定電泳,ELP 泳道: 固定液G 泳道： 抗 IgG 重鏈抗血清A 泳道： 抗 IgA 重鏈抗血清M 泳道： 抗 IgM 重鏈抗血清K 泳道： 抗? 輕鏈抗血清L 泳道：

28、 抗 ?輕鏈抗血清,儀器： Sebia 瓊脂糖凝膠電泳儀 試劑：免疫固定電泳試劑靈敏度：31-125ug/L,正常血清免疫固定,確認IgM ?型M蛋白,血清蛋白免疫固定電泳應用舉例 （1）,,IF,在?區(qū) 發(fā)現(xiàn)疑似M蛋白,,輕鏈病,血清蛋白免疫固定電泳特殊病例,免疫固定結果顯示為單獨的 l 成分,本周氏蛋白,1844年Henry Bence Jones 在一個骨髓瘤患者尿中發(fā)現(xiàn)一種具有特殊凝溶性質的蛋白40－60℃發(fā)生沉淀，加

29、熱煮沸時溶解，冷卻后又沉淀輕鏈二聚體大多數(shù)骨髓瘤患者尿中有本周氏蛋白,漿細胞病的診斷和治療監(jiān)測某些情況下，特別是對輕鏈型的M蛋白，比血清免疫固定電泳更加敏感因為游離輕鏈的分子量比較?。?5－50KDa）更容易通過腎臟清除進入尿液中，從而在尿中被檢測到,本周氏蛋白電泳的臨床意義,90~100℃,40~60℃,室溫,本周氏蛋白檢測方法—熱沉淀反應法,本周氏蛋白檢測方法---尿液的免疫固定電泳,,,重鏈,參考泳道,復合輕鏈,游離

30、輕鏈,4.尿蛋白電泳,68,,,,,,白蛋白轉鐵蛋白免疫球蛋白小分子蛋白,,小分子蛋白,微量免疫球蛋白， 轉鐵蛋白，白蛋白,腎小球濾過,白蛋白轉鐵蛋白免疫球蛋白小分子蛋白,,,,,,小分子蛋白,腎小管重吸收,,,,,,,微量免疫球蛋白，轉鐵蛋白，白蛋白,尿液,SDS尿蛋白電泳圖譜,,,,,SDS,,SDS,,+,,-,,,,分子量標記 (kDa),14.4,30,43,67,94,,,,,,,,,,,低分子量 (&l

31、t; 67 kDa),高分子量(> 67 kDa),白蛋白( 67 kDa),分子篩,腎小球性蛋白尿,,,,,,< 67 kDa,白蛋白,> 67 kDa,腎小管性蛋白尿,,混合性蛋白尿,> 67 kDa,< 67 kDa,,,,,,,,,SDS尿蛋白電泳,,15號樣本BJ電泳,尿蛋白電泳的聯(lián)合應用,尿本周氏蛋白電泳,,游離kappa,敏感性高：檢測限為15mg/L標本收集：隨機尿，無需濃縮(推薦晨尿

32、)檢測結果尿蛋白的全貌直觀反映腎臟受損部位對不愿意進行腎穿檢查的病人,可作為替代實驗動態(tài)觀察：對確診或不典型患者可進行動態(tài)觀察,SDS非濃縮尿蛋白電泳檢測的優(yōu)勢,第四部分-給臨床的報告單格式,報告單必須含有以下內(nèi)容: 電泳條帶圖譜 檢測結果的M蛋白峰必須給出%和g/L數(shù)值 全部圖譜條帶的解析,77,尿蛋白電泳報告單,,電泳標準報告單,,,北京康圣安科技發(fā)展有限公司,78,,Thanks,喬玉龍電話：156037