飼料中有毒有害物質的測定課件

1、4/4/2024 1:44 AM,1,飼料中有毒有害物質的測定,黎觀紅江西農業(yè)大學動物科技學院,4/4/2024 1:44 AM,2,9 飼料中有毒有害物質的測定P244,（一）飼料質量營養(yǎng)質量：飼料營養(yǎng)成分含量；技術質量：飼料的物理特性、如顆粒大小、形狀、硬度、適口性等、混合均勻度；衛(wèi)生（安全）質量：對動物、人和環(huán)境的安全；情緒質量：倫理標準或感覺可影響對質量的討論， 如有爭議的動物性原料 或人造著色劑和調味劑。,一、概述,

2、,公眾對飼料質量重要性的認識的變化 表1,4/4/2024 1:44 AM,3,9 飼料中有毒有害物質的測定,（二）幾起典型的飼料安全事故２０世紀８０年代中期至９０年代中期瘋牛?。ā芭：＞d狀腦病” ）的暴發(fā)流行。1999年1月15日以來，比利時、荷蘭、法國、德國相繼發(fā)生因動物飼料被二惡英污染，導致畜禽類產品及乳制品含高濃度二惡英事件。 “瘦肉精”中毒問題、“毒奶粉（2008）”、“紅心鴨蛋（使用蘇丹紅，2006）”、“多寶魚

3、（藥物殘留，2006）”等。 “配合飼料有毒”、“配合飼料生產的肉蛋奶不能吃”、“小孩肥胖原因是吃了含激素的肉”。,一、概述,飼料安全等于畜產品安全！,4/4/2024 1:44 AM,4,都是藥殘惹的禍！,蘇丹紅,三聚氰胺,瘋牛病二惡英瘦肉精三聚氰胺蘇丹紅（紅心鴨蛋）孔雀石綠（水產品）抗生素等藥物殘留……,,,,,,,4/4/2024 1:44 AM,5,“飼料雞”,“土雞”,新概念雞蛋全是“扯蛋”？,4/4/202

4、4 1:44 AM,6,9 飼料中有毒有害物質的測定,（三）飼料衛(wèi)生標準——強制性國家標準 對飼料中有獨有害物質及有害微生物以法律形式做出的統(tǒng)一規(guī)定。 1991年版《飼料衛(wèi)生標準》：覆蓋面較小，造成許多事故糾紛無判定依據，一些重要的產品衛(wèi)生指標沒有規(guī)定等。,一、概述,4/4/2024 1:44 AM,7,9 飼料中有毒有害物質的測定,（三）飼料衛(wèi)生標準——強制性國家標準 2001年新版GB13078－2001《飼料衛(wèi)生

5、標準》： 有害物質及微生物衛(wèi)生指標項目增加了“鉻”在皮革、蛋白粉和雞、豬配合飼料中的允許量指標。即由原標準規(guī)定的16項，修訂為17項。新版標準覆蓋的產品品種達66種，是原標準的3倍多。砷在磷酸鹽產品中的允許量指標由每千克產品10毫克，修訂為20毫克。氟在磷酸氫鈣產品中的允許量指標由每千克2000毫克，修訂為1800毫克。黃曲霉毒素B1指標將肉用仔雞配合飼料分為前期料和后期料，其允許量分別為每千克飼料中10微克和20微克。補充

6、規(guī)定了與各項指標相對應的試驗方法，消除了原標準沒有指明特定試驗方法的缺陷。,一、概述,4/4/2024 1:44 AM,8,9 飼料中有毒有害物質的測定,（三）飼料衛(wèi)生標準——強制性國家標準現行的飼料衛(wèi)生標準將進行不斷的修訂和完善！相對于發(fā)達國家的飼料衛(wèi)生標準，我國的飼料衛(wèi)生標準項目偏少。新農藥的不斷出現（現行飼料衛(wèi)生標準只規(guī)定了兩種農藥的限量標準：六六六、滴滴涕）。敵敵畏 、敵百蟲 、甲胺磷 、菊酯類 、馬拉磷 、蚜螨磷安全

7、限量標準草案。 測定方法靈敏度的提高，對于某些有毒有害物質限量的規(guī)定將可能發(fā)生改變。新飼料資源的開發(fā)利用。,一、概述,4/4/2024 1:44 AM,9,9 飼料中有毒有害物質的測定,（四）飼料中有毒有害物質的分類1. 按來源分： 天然：棉酚、硫甙、脲酶、胰蛋白酶抑制劑等 次生：微生物次生代謝產物，如黃曲霉毒素B1、由氨基酸產生的組胺、尸胺、腐胺、精胺等 外源性：重

8、金屬污染，2 按性質分： 有機：棉籽餅粕、菜籽餅粕、蓖麻餅粕中的蓖麻毒素和蓖麻堿、四 季豆中的皂甙（皂素）和胰蛋白酶抑制劑等，病原微生物、霉菌毒素、有機農藥等。 無機：鉛、砷、鉻、鎘、汞、氟、鉬等。,一、概述,,,4/4/2024 1:44 AM,10,9 飼料中有毒有害物質的測定,砷的毒性：砷與動物體組織中酶的巰基結合使之失活，損害機體全身組織。砷的氧化物毒性很高，三價砷毒性>五價；無機砷毒性

9、>有機砷：砒霜（As2O3 ）。一般情況下，植物性飼料砷含量很低。植物飼料中砷含量與土壤中的水平、農藥污染和工業(yè)污染有關。,二、飼料中總砷的測定（P248）,4/4/2024 1:44 AM,11,,9 飼料中有毒有害物質的測定,二、飼料中總砷的測定,有機砷飼料添加劑：對氨基苯砷酸（阿散酸）、對氨基苯砷酸鈉和3-硝基-4-羥基苯砷酸 （洛克殺生 ）。 促生長，抗球蟲及著色（使皮膚紅潤，毛色發(fā)亮）等功效。

10、我國制定的飼料中砷測定標準方法是測定飼料中總砷含量（目前的檢測方法還不能區(qū)分有機砷和無機砷），而衛(wèi)生標準中砷的限量標準為無機砷，造成了使用有機砷添加劑的配合料，含砷量超過我國國家允許量標準，這也使得檢測結果無法依據產品衛(wèi)生標準進行質量判定。,4/4/2024 1:44 AM,12,9 飼料中有毒有害物質的測定,二、飼料中總砷的測定,4/4/2024 1:44 AM,13,9 飼料中有毒有害物質的測定,（一）概述黃曲霉毒素（aflat

11、oxins, AF）是由一組真菌（黃曲霉、曲霉等）產生的一組化學結構類似的真菌毒素。主要污染花生、玉米、棉籽及其餅粕等。對人和動物均具有極強的毒性和致癌性。黃曲霉毒素還可在動物產品中蓄積，影響人體健康。目前已分離鑒定出12種，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。其中黃曲霉毒B1最為多見，其毒性和致癌性也最強。在自然條件下，飼料污染的黃曲霉毒素主要為AFB1、B2 、G1 、G2，其中以AF

12、B1含量最高。黃曲霉毒素的毒性、致癌性和蓄積性——飼料產品質量控制中的必檢項目。,二、飼料中黃曲霉毒素B1的測定,4/4/2024 1:44 AM,14,9 飼料中有毒有害物質的測定,(二)檢測方法酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）薄層層析法（thin layer chromatography，TLC）快速篩選法,,二、飼料中黃曲霉毒素B1的測定（P288）,

13、4/4/2024 1:44 AM,15,9 飼料中有毒有害物質的測定,酶聯免疫吸附法1、原理 ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。以待測抗原（或抗體）與酶標抗體（或抗原）的特異結合反應為基礎，通過酶活力測定來確定抗原（或抗體）含量。 特點：很強的特異性：建立在抗原與抗體免疫學反應的基礎上。 很高的靈敏度：酶催化反應。對于黃曲霉毒素B1，ELISA法最低可檢出0.1μg。,二、

14、飼料中黃曲霉毒素B1的測定,4/4/2024 1:44 AM,16,9 飼料中有毒有害物質的測定,酶聯免疫吸附法 ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體，酶標記的抗原或抗體，酶作用的底物。,二、飼料中黃曲霉毒素B1的測定,4/4/2024 1:44 AM,17,酶聯免疫吸附法A、抗體將某種抗原經各種途徑免疫動物，成熟的B細胞克隆受到抗原刺激后，將抗體分泌到血

15、清和體液中。實際上血清中的抗體是多種單克隆抗體的混合物，因此稱之為多克隆抗體。,9 飼料中有毒有害物質的測定,4/4/2024 1:44 AM,18,單克隆抗體是由生長在細胞培養(yǎng)物中的同一B細胞的群體（一個克?。┖铣刹⒎置诘?、均一的、識別同一抗原表位的抗體。,4/4/2024 1:44 AM,19,酶聯免疫吸附法B、酶與底物：在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish  peroxidase,

16、60; HRP)和堿性磷酸酶(alkaline  phosohatase,  AP)。在少數商品ELISA試劑中，應用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。辣根過氧化物酶底物：鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS。用2mol/L硫酸終止酶反應。堿性磷酸酶底物：一般采用

17、對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl  phosphate, p-NPP)作為底物，用NaOH終止酶反應。,9 飼料中有毒有害物質的測定,4/4/2024 1:44 AM,20,酶聯免疫吸附法B、酶與底物：在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish  peroxidase,  HRP)和堿性磷酸酶(alkaline  phosohatase,  AP)。

18、在少數商品ELISA試劑中，應用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。辣根過氧化物酶底物：鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS。用2mol/L硫酸終止酶反應。堿性磷酸酶底物：一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl  phosphate, p-NPP)作為底物，用Na

19、OH終止酶反應。,9 飼料中有毒有害物質的測定,4/4/2024 1:44 AM,21,酶聯免疫吸附法ELISA最常用的四種方法：直接法測定抗原；間接法測定抗體；雙抗體夾心法測定抗原；競爭法測定抗原。,9 飼料中有毒有害物質的測定,4/4/2024 1:44 AM,22,（1）  直接法測定抗原 A.      將抗原吸附在載體表面； B. 

20、;     加酶標抗體，形成抗原—抗體復合物； C. 加底物。底物的降解量＝抗原量。,4/4/2024 1:44 AM,23,（2）間接法測定抗體A.      將抗原吸附于固相載體表面；B.      加抗體, 形成抗原-抗體復合物; C.   &

21、#160;  加酶標抗體；D. 加底物。 測定底物的降解量＝抗體量。,4/4/2024 1:44 AM,24,（3）雙抗體夾心法測定抗原A.      將抗體吸附于固相表面; B.      加抗原，形成抗原-抗體復合物; C.     加酶標抗體; E. 加底

22、物。底物的降解量＝抗原量。,4/4/2024 1:44 AM,25,（4）競爭法測定抗原A.  將抗體吸附在固相載體表面; B. 加入酶標抗原和待測抗原，競爭結合抗體； 對照只加入酶標抗原； C. 加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知抗原量。,4/4/2024 1:44 AM,26,黃曲霉毒素B1酶聯免疫競爭檢測法,,,4/4/2024 1:44 AM,27,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

23、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,樣品,,黃曲霉毒素B1分子,4/4/2024 1:44 AM,28,微 孔 表 面 情 況,,,,,AFB1抗體,4/4/2024 1:44 AM,29,標準品,4/4/2024 1:44 AM,30,,,標準溶液,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

24、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,4/4/2024 1:44 AM,31,酶標抗原,,,,,,,,,,,,4/4/2024 1:44 AM,32,酶標抗原,酶,AFB1,4/4/2024 1:44 AM,33,標準品, 樣品 和 酶標抗原加進微孔,4/4/2024 1:44 AM,34,,,,樣品

25、,酶標抗原,樣 品 孔,先加,后加,4/4/2024 1:44 AM,35,,,,標準品,酶標抗原,標 準 孔,先加,后加,4/4/2024 1:44 AM,36,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

26、孵育30分鐘,抗 原 與 抗 體 結 合,4/4/2024 1:44 AM,37,微 孔 清 洗,4/4/2024 1:44 AM,38,洗滌5次，間隔2分鐘,,,,,,,,,,,,,,,4/4/2024 1:44 AM,39,加入酶催化反應底物,4/4/2024 1:44 AM,40,,,,,,,,,,,,加入反應底物A和B,,,孵 育 15 分 鐘,4/4/2024 1:44 AM,41,,,,,,,,,,,,顯

27、 色,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,4/4/2024 1:44 AM,42,,,,,,,,,,,,4/4/2024 1:44 AM,43,反 應 孔,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,4/4/2024 1:44 AM,44,陰 性 對 照 孔,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

28、,,,,,,,,,,,4/4/2024 1:44 AM,45,,陰性對照孔=沒有黃曲霉毒素B1分子與酶標抗原競爭所有抗體都與酶標抗原結合,4/4/2024 1:44 AM,46,陽 性 對 照 孔,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,4/4/2024 1:44 AM,47,,1 ng/ml 標準孔 = 黃曲霉毒素B1分子結合到抗體上剩余的抗體再與酶標抗原結合,4/4/2024 1:44

29、AM,48,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,陽 性 樣 品,,,,,,,,,,,酶標抗原結合得越少，顏色越淺,,4/4/2024 1:44 AM,49,,加入終止液，反應液由藍色變成黃色，上酶標儀讀取數據，畫標準曲線,4/4/2024 1:44 AM,50,,,,,,,,調零孔,陰性孔,0.1 ng/ml,0.5 ng/ml,1 ng/ml,5 ng/ml,10 ng/m

30、l,酶聯免疫競爭法標準曲線,,,,,,0.1,1,10,ng/ml,,,,,,,O.D.,,,4/4/2024 1:44 AM,51,不同溫度條件下的標準曲線,,,,,,0.1,1,10,ng/ml,,,,,,,O.D.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,調零孔,陰性孔,0.1 ng/ml,0.5 ng/ml,1 ng/ml,5 ng/ml 10 ng/ml,4/4/2024 1:44 AM,52,以