Tlr3在小鼠感光細胞中的作用研究.pdf

1、目的：已有研究表明，固有免疫炎癥反應在干性年齡相關性黃斑變性（干性AMD）中起到十分重要的作用。但是，這些研究目前為止主要集中在視網膜色素上皮細胞（RPE）上。隨著干性AMD的病程進展，RPE和感光細胞會發(fā)生變性，并且在RPE層和Bruch膜內膠原層之間也會出現玻璃膜疣的蓄積。研究證實，在RPE中， Toll樣受體3（Tlr3）能夠被玻璃膜疣的成分激活并介導免疫炎癥反應。我們前期的研究表明，Tlr3在小鼠視網膜感光細胞中高度表達。雖然感

2、光細胞和RPE均在AMD中發(fā)生變性，但Tlr3在感光細胞的作用卻并不清楚。因此，本研究旨在以往研究的基礎上，探究Tlr3在感光細胞中的作用。
　　方法：1.我們首先利用免疫熒光染色和半定量PCR分析去檢測Tlr3在小鼠視網膜和小鼠感光細胞系661W細胞中的表達情況。
　　2.我們在1月齡的C57BL/6J小鼠視網膜下腔注射Tlr3的配體Poly I:C，建立免疫激活動物模型。利用眼底照相和OCT（光學相關斷層成像術）技術來觀

3、察小鼠視網膜結構的變化情況。采用全視野ERG（視網膜電圖）和Focal ERG來進一步檢測小鼠視網膜功能是否受影響。然后我們用TUNEL染色技術、線粒體膜電位檢測和Annexin-V/PI雙染實驗來明確Tlr3配體引起的細胞凋亡情況，此外，免疫熒光染色被用來檢測視網膜免疫細胞活化情況。
　　3.我們將Poly I:C處理組作為實驗組，將Poly dI:dC處理組和PBS處理組作為對照組，分別去刺激小鼠感光細胞661W細胞，然后進行

4、RNAseq，并將實驗組和對照組的測序結果進行比對。我們篩選出部分表達上調的編碼炎癥因子的基因作為候選基因，再利用RT-PCR去檢測這些候選基因的表達情況。
　　結果：1.免疫染色結果顯示Tlr3主要表達在小鼠視網膜神經節(jié)細胞、RPE以及感光細胞，在感光細胞中主要位于內節(jié)部位。半定量PCR檢測了Tlr家族成員Tlr1-Tlr9在661W細胞中的表達情況，結果顯示在661W細胞中共有4種Tlrs有表達，包括Tlr2，Tlr3，Tlr

5、4和Tlr5，其中Tlr3的表達量最高。進一步利用661W細胞進行免疫印跡實驗同樣檢測到Tlr3的表達。
　　2.視網膜結構：眼底照相顯示小鼠視網膜注射區(qū)域的RPE嚴重損害，OCT結果也同樣顯示了不僅僅是RPE層，連同感光細胞層在Poly I:C處理后也嚴重受損。視網膜功能：全視野ERG結果顯示暗適應ERG和混合反應ERG的波幅明顯下降，而Focal ERG結果顯示波幅明顯下降，表明在注射區(qū)域以及注射區(qū)域以外視網膜功能受到明顯損害

6、。感光細胞凋亡情況：經Poly I:C刺激的661W細胞和小鼠視網膜感光細胞均發(fā)生明顯凋亡。免疫炎癥反應：小鼠接受Poly I:C注射后，其視網膜免疫細胞如Müller細胞和小膠質細胞發(fā)生激活；而Poly I:C刺激培養(yǎng)的661W細胞后，多種細胞炎癥因子表達水平明顯升高。此外，Poly I:C刺激離體培養(yǎng)的神經視網膜后也同樣引起細胞炎癥因子表達上升。
　　3. RNAseq結果顯示，和Poly dI:dC對照組相比，Poly I:

7、C轉染細胞后更多的基因表達發(fā)生改變，其中 Tlr3和一些細胞炎癥因子如Cxcl10、Ccl5和Il33的表達也明顯上調。
　　結論：我們利用Tlr3的配體Poly I:C分別去刺激C57BL/6J小鼠視網膜、鼠源的感光細胞系661W細胞以及離體培養(yǎng)的小鼠神經視網膜，結果發(fā)現，感光細胞能夠作為Poly I:C刺激的直接作用靶點。此外，Tlr3作為Poly I:C刺激的主要感受器，能夠進一步觸發(fā)細胞的炎癥反應，最終導致感光細胞發(fā)生凋亡