單分子水平研究活細(xì)胞中胰島素與其受體復(fù)合物的運(yùn)動、聚集及內(nèi)吞.pdf

1、全文分為四章： 本文第一章對單分子檢測(SMD)的意義作了簡單的介紹。SMD技術(shù)在生命科學(xué)上的應(yīng)用可以在單分子水平上揭示分子的動態(tài)行為、動力學(xué)過程和機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)大量分子集合體中分子個(gè)體的性質(zhì)和行為。這項(xiàng)技術(shù)已被大量應(yīng)用于研究細(xì)胞外和活細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，目前成為深入了解生物體系中生物分子的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和相互作用等信息的新方法。這一章中我們還對幾種在生物大分子SMD中應(yīng)用較為廣泛的技術(shù)：全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)(TIRFM)、激光掃描共聚

2、焦熒光顯微術(shù)(LSCFM)、近場掃描光學(xué)顯微術(shù)(NSOM)、多光子激發(fā)熒光顯微術(shù)(MPEM)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、熒光壽命成像(FLJM)和熒光相關(guān)光譜(FCS)等進(jìn)行了綜述。其中對TIRFM的綜述已發(fā)表在陳宜張、林其誰主編的《生命科學(xué)中的單分子行為及細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)檢測》一書中(2005年，198-218頁，科學(xué)出版社，北京)。 第二章中我們發(fā)展了一種簡單的細(xì)胞內(nèi)熒光顯微術(shù)。此方法是將激光調(diào)節(jié)到在細(xì)胞上表面發(fā)生全內(nèi)反射，此

3、時(shí)激光只照射到細(xì)胞內(nèi)部，減少了噪音，使分辨率大大提高。我們從理論上對這種方法進(jìn)行了分析，并以實(shí)例進(jìn)行了驗(yàn)證。這種技術(shù)相對于已有各種SMD技術(shù)能更方便的觀測細(xì)胞質(zhì)膜上表面、細(xì)胞內(nèi)部或細(xì)胞質(zhì)膜下表面的單個(gè)熒光生物大分子，并可獲得高分辨率圖像。細(xì)胞內(nèi)熒光顯微術(shù)具有以下幾個(gè)顯著特點(diǎn): 1．可在單分子水平上對貼壁細(xì)胞上表面觀測，彌補(bǔ)了常規(guī)全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)無法觀測細(xì)胞上表面的缺陷，避免了細(xì)胞在貼壁狀態(tài)固定細(xì)胞的玻片對細(xì)胞的生命過程造成的不

4、利影響，使得對活細(xì)胞生命過程的研究更方便，得到的結(jié)果更可靠，甚至可以研究用常規(guī)全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)無法研究的事件。 2．可對細(xì)胞內(nèi)不同位置成像。這種技術(shù)只檢測細(xì)胞內(nèi)的熒光，而不檢測細(xì)胞外的熒光。與檢測細(xì)胞內(nèi)、外熒光的常規(guī)的落射熒光顯微術(shù)(Epi-FM)相比較，這種技術(shù)獲得熒光圖像的分辨率和對比度更高。 3．對細(xì)胞下表面成像也能達(dá)到與常規(guī)的細(xì)胞下表面全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)相當(dāng)?shù)姆直媛剩⒛苡糜诩?xì)胞下表面的單分子檢測。 4

5、．與傳統(tǒng)的方法比較，能夠快速對細(xì)胞不同區(qū)域進(jìn)行觀測，這對于研究分子在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動及位置變換具有突出的優(yōu)勢。 此部分內(nèi)容已被Talanta接收，全文已在網(wǎng)上刊登，正待印刷。 第三章中我們以第二章所提出的細(xì)胞內(nèi)熒光顯微術(shù)，結(jié)合落射熒光顯微術(shù)(Epi-FM)和激光掃描共聚焦熒光顯微術(shù)(LSCFM)，對活的人正常肝細(xì)胞HL-7702中胰島素受信號轉(zhuǎn)導(dǎo)早期階段在單分子水平進(jìn)行了研究。信號分子胰島素(insulin)與細(xì)胞質(zhì)膜上胰島

6、素受體(IR)結(jié)合可產(chǎn)生一系列生理現(xiàn)象，其早期過程包括質(zhì)膜上胰島素與胰島素受體的復(fù)合物(IR-insulin)的運(yùn)動、聚集以及內(nèi)涵體的形成等，這些現(xiàn)象在早期曾用形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)等方法進(jìn)行研究，但大多將大量細(xì)胞溶解后通過直接測量放射性標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物的強(qiáng)度進(jìn)行判斷。由于受大量細(xì)胞平均化檢測方法的限制，無法動態(tài)觀察這些過程。我們在單分子水平上對細(xì)胞質(zhì)膜上IR-insulin的運(yùn)動、聚集以及內(nèi)涵體的形成進(jìn)行了實(shí)時(shí)動態(tài)研究，觀察到如下的一些現(xiàn)

7、象： 1．在實(shí)時(shí)追蹤質(zhì)膜上IR-insulin的聚集過程時(shí)，發(fā)現(xiàn)聚集體中含有IR-insulin的個(gè)數(shù)不均一，有兩個(gè)IR-insulin復(fù)合體同時(shí)聚集，也有三個(gè)IR-insulin復(fù)合體同時(shí)聚集；而且聚集體形成過程也不相同。此外，還觀察到了質(zhì)膜上IR先捕獲溶液中insulin，然后通過擴(kuò)散運(yùn)動與質(zhì)膜上另一個(gè)已形成的IR-insulin復(fù)合體聚集，隨后又有一分子insulin被質(zhì)膜上瓜捕獲，并且與前面形成的含有兩個(gè)IR-insul

8、in的聚集體聚集，形成了三個(gè)瓜．insulin的聚集體。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映出了單個(gè)聚集體形成方式的多樣性和時(shí)間上的不同步性，這在大量分子平均研究中是不能夠體現(xiàn)出來的。 2．我們根據(jù)熒光強(qiáng)度分析了56個(gè)聚集體中含有IR-insulin復(fù)合體的個(gè)數(shù)。發(fā)現(xiàn)聚集體中含IR-insulin復(fù)合體由2個(gè)到14個(gè)不等。含IR-insulin復(fù)合體個(gè)數(shù)少的聚集體的數(shù)量多，含IR-insulin復(fù)合體個(gè)數(shù)多的聚集體的數(shù)量少。并對這些現(xiàn)象的成因進(jìn)行了解

9、釋。 3．在對同一細(xì)胞的質(zhì)膜下表面和上表面聚集體的觀察中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞上表面IR-insulin聚集體較細(xì)胞下表面明顯多，因?yàn)榧?xì)胞下表面質(zhì)膜貼壁與玻片接觸較緊密，不利于膜上IR的運(yùn)動，這反映出了單個(gè)細(xì)胞不同部位受外界影響而產(chǎn)生的不同反應(yīng)。 4．通過比較胰島素受體抗體(anti-IR)和insulin與IR的作用，證明了上述所觀察到的現(xiàn)象是由于insulin誘導(dǎo)產(chǎn)生的。 上述在單分子水平上的研究的結(jié)果描述了在insu

10、lin刺激下活細(xì)胞上瓜的一些未見報(bào)道的生理現(xiàn)象。 在第四章中我們用第二章所提出的細(xì)胞內(nèi)熒光顯微術(shù)及全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)(TIRFM)在活體狀態(tài)下實(shí)時(shí)觀測了人正常肝細(xì)胞HL-7702質(zhì)膜上IR介導(dǎo)的內(nèi)吞及生成的內(nèi)涵體。由于研究受體介導(dǎo)入胞的機(jī)制對于了解胞內(nèi)信息傳遞途徑有重要意義，目前已有多種方法用于研究內(nèi)吞和囊泡運(yùn)輸。如采用電鏡或生化方法等來觀察到內(nèi)吞的配體在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑和獲得動力學(xué)信息，但是這些方法只能得到靜態(tài)圖片或以破壞細(xì)胞

11、結(jié)構(gòu)和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的完整性來獲得大量分子的平均結(jié)果。我們則在活細(xì)胞狀態(tài)下進(jìn)行研究，結(jié)果反映出了囊泡間和分子間的個(gè)體差異。研究內(nèi)容主要有幾下幾方面： 1．觀察到了細(xì)胞質(zhì)膜上單個(gè)IR-insulin復(fù)合體和胞內(nèi)m-insulin內(nèi)涵體。通過anti-IR作用于細(xì)胞質(zhì)膜瓜的對比實(shí)驗(yàn)，分析了insulin對IR誘導(dǎo)活化作用和細(xì)胞對瓜循環(huán)代謝過程的兩種不同現(xiàn)象，說明了胞內(nèi)IR-insulin內(nèi)涵體的生成是由于insulin對IR的活化作用

12、。 2．通過觀察囊泡在胞內(nèi)的運(yùn)輸發(fā)現(xiàn)，質(zhì)膜上單個(gè)IR-insulin復(fù)合體數(shù)量增多后，胞內(nèi)內(nèi)涵體才出現(xiàn)。早期內(nèi)體在近膜區(qū)形成后，晚期內(nèi)體才沿核周圍形成。 3．在實(shí)時(shí)觀測IR-insulin聚集體內(nèi)吞過程中，發(fā)現(xiàn)聚集體從質(zhì)膜表面內(nèi)吞進(jìn)入胞內(nèi)的速度是不均一的，進(jìn)入胞內(nèi)的速度是一個(gè)由慢到快再到慢的過程。我們從生理過程對這一現(xiàn)象進(jìn)行了解釋。 4．通過對胞內(nèi)單個(gè)內(nèi)涵體連續(xù)觀測，還發(fā)現(xiàn)內(nèi)涵體的運(yùn)動呈不規(guī)則變化，但是這些變化均