DNA化學損傷機制的理論研究.pdf

1、除少數(shù)RNA病毒外，DNA幾乎是所有生物遺傳信息的載體。在生物體內，DNA分子結構在生命活動的過程中基本保持不變，這是細胞乃至整個生物體生命得以維系、各種生命特征得以傳承的根本保障。但是，DNA分子結構的穩(wěn)定性也不是絕對的，生物體內部及外部環(huán)境的很多物理和化學因素均可能造成DNA分子結構的異常變化，這就是DNA的損傷。原則上，DNA分子結構的任何異常變化均稱為DNA損傷，包括DNA雙螺旋的非正常解鏈、鏈的斷裂與交聯(lián)、嵌合劑在雙鏈間的插入

2、、堿基的異構化與脫落、非正常堿基的摻入、堿基上的化學修飾以及由此引起的DNA二級結構、三級結構的變化等等。為保證機體生理活動的正常進行、生命過程的延續(xù)和遺傳的穩(wěn)定性，生物體內形成了一整套相當完善的修復系統(tǒng)，可使DNA的損傷得到最大限度的修復。生物體內未被修復的DNA損傷是極少量的，但就是這些極少量未被修復的DNA損傷卻可能對機體產(chǎn)生非常重大的影響。如果發(fā)生在復制過程中，DNA損傷有可能傳給子代，導致基因突變，造成遺傳性疾病或物種的變異：

3、如果發(fā)生在端粒DNA上，則會影響端粒DNA的生理功能；如果發(fā)生在DNA的轉錄過程中，就會產(chǎn)生錯誤編碼的RNA，進而影響翻譯過程，導致無法合成具有正常功能的蛋白質。DNA損傷會導致細胞的老化、惡變或死亡，從而造成生物體的衰老、腫瘤及其他與基因相關的疾病?；蛲蛔儗ι镆膊皇峭耆泻Φ?，一些對生物有利的突變可能被生物保留下來，最終導致生物的進化。從這個意義上說，DNA損傷亦是生物進化的必要條件。DNA的人工損傷(人工誘變)是治療癌癥及遺傳性

4、疾病的重要手段；隨著基因工程的發(fā)展，DNA人工誘變越來越多的被用來改良甚至創(chuàng)造物種。 大多數(shù)DNA損傷是由化學因素造成的，從本質上說DNA損傷是一種化學過程。利用化學的理論或實驗方法對DNA損傷進行研究，探明其發(fā)生、發(fā)展的微觀機制，可以為抑制不良損傷和利用、開發(fā)有利損傷奠定基礎并提供理論指導，這在化學以及生命科學領域均是具有重大理論和實際意義的研究課題。實驗上可以檢測DNA損傷，但由于損傷的比例極小且生理環(huán)境復雜，通過實驗方

5、法在分子水平上研究損傷的機制還很困難。利用理論方法研究DNA損傷的機制是目前最可行和最重要的手段。本文利用密度泛函理論方法(DFT)對堿基異構化、水解脫氨和氧化脫氨造成的DNA損傷機制進行了理論研究，找到了過程的過渡態(tài)和最低反應途徑，討論了過程的熱力學和動力學性質，獲得了一些有意義的結果。 1．計算模型的建立 由于計算方法和計算機發(fā)展水平的制約，對DNA等大分子的理論研究必須進行模型化處理。我們對四種計算模型進行了研究

6、，結果表明，截斷糖苷鍵并用H飽和，即選擇自由堿基模型完全可以滿足堿基損傷過程研究的要求，延后截斷(相當于擴大糖苷鍵的飽和基團)對于計算結果的進一步改善沒有明顯作用。這也同時說明，脫氧核糖基團的給、吸電子能力大體與氫相當。 2．計算方法的選擇 為了考察計算方法對計算結果的影響，我們分別用HF、B3LYP和MP2方法在6-3l+G<'*>木水平上對了DNA堿基異構體進行了優(yōu)化計算。結果表明，HF方法給出的能量最高，MP2方法

7、得到的能量次之，B3LYP方法給出的能量最低。用B3LYP和MP2方法優(yōu)化得到的胞嘧啶鍵長數(shù)據(jù)與實驗值比較接近。MP2和B3LYP方法均考慮了電子相關能，這對研究具有共軛體系的堿基是必要的，但MP2方法耗時較多，又不能給出更好的結果，因此在實際計算中，我們均利用B3LYP方法在6-31+G<'*>水平上進行優(yōu)化計算。為了獲得更好的能量精度，在優(yōu)化的基礎上利用6-311+G<,**>基組做單點能計算并考慮零點能校正。 3．堿基的異

8、構化損傷 對DNA堿基異構化過程的研究結果表明，所有異構化過程可分為兩大類：一類為原子間的質子轉移過程，另一類為亞氨基上的質子擺動過程。這些異構化過程均存在過渡態(tài)，它們的Hessian矩陣只有一個負本征值，對應的簡正振動具有惟一的虛頻率，IRC解析結果證明這些過渡態(tài)分屬于各自的最低反應途徑。原子間質子轉移過程的過渡態(tài)包含一個四元環(huán)，質子通過此四元環(huán)發(fā)生原子間轉移。該四元環(huán)為平面結構并且與堿基骨架共平面；亞氨基上質子擺動過程的過渡

9、態(tài)關鍵部分是由亞氨基與直接相連的碳原子構成的三元結構。在原子間質子轉移的過渡態(tài)中，伴隨著新鍵的形成和舊鍵的斷裂，原子間發(fā)生了電荷轉移，使得整個分子的電荷出現(xiàn)了重新分布，相鄰原子間的鍵長也發(fā)生了明顯變化。在亞氨基質子擺動過程的過渡態(tài)中，直接涉及的兩個化學鍵均被削弱，同樣存在電荷轉移以及由此造成的電荷重新分布；質子擺動過程沒有凈的化學鍵形成與斷裂，屬于幾何異構過程。直接導致DNA正常構型變化(DNA損傷)的異構化過程為堿基酮式與烯醇式之間的

10、變化或氨基與亞氨基之間的轉變，它們均屬于原子間的質子轉移轉移過程。它們的反應勢壘大于140KJ/mol，常溫下其反應速率常數(shù)小于10<'-10>/S，說明堿基的異構化是一個比較緩慢的過程。過渡態(tài)的虛頻數(shù)值表明原子間的質子轉移過程具有較大的隧道效應。其它原子間質子轉移過程不直接導致DNA損傷，但其性質和行為與上述過程大體類似。亞氨基質子擺動過程與原子間質子轉移過程具有明顯不同的動力學性質。它們的反應勢壘約在100KJ/mol左右，速率常數(shù)

11、較大，隧道效應較小。熱力學分析表明，四個堿基的正常構型均是異構體中熱力學最穩(wěn)定的構型，直接導致堿基正常構型變化的異構化過程均屬于熱力學上的非自發(fā)過程；在研究溫度范圍內，根據(jù)平衡常數(shù)得到的最大異構化率分別約為：胞嘧啶10<'-3>～10<'-2>；胸腺嘧啶10<'-13>～10<'-8>；腺嘌呤10<'-18>～10<'-12>：鳥嘌呤10<'-3>～10<'-2>?？梢姡膫€堿基中胞嘧啶和鳥嘌呤具有較大的平衡損傷比率。嘌呤堿基與嘧啶堿基

12、相比，無論是質子轉移還是質子擺動，嘌呤堿基過渡態(tài)的虛頻率均小300左右，這說明嘧啶堿基異構化的隧道效應大于嘌呤堿基的異構化的隧道效應。這個結果同時表明，在堿基的異構化過程中，隧道效應不僅與質子遷移的方式有關，同時也受質子所處的化學環(huán)境的影響。 研究結果表明，原子間質子轉移需要活化σ鍵和π鍵，而質子擺動過程基本上只需要活化π健，因此原子間質子轉移的勢壘高于質子擺動的勢壘。異構化過程的過渡態(tài)是由于分子振動形成的。對于形成過渡態(tài)的振動

13、模式，原子間質子轉移涉及多個原子的位移和多個鍵的伸縮和彎曲振動，振動能級躍遷需要較高的能量，而質子擺動主要涉及兩個原子的位移和一個鍵的伸縮振動，這亦是造成反應勢壘不同的原因。 4．堿基的水解脫氨損傷 DNA的四個堿基中有三個帶有環(huán)外氨基，可以通過水解脫除，其中胞嘧啶水解脫氨形成尿嘧啶，腺嘌呤水解脫氨形成次黃嘌呤，鳥嘌呤水解脫氨形成黃嘌呤。研究結果表明，三個堿基水解脫氨過程均需要經(jīng)過兩個過渡態(tài)和一個中間體。反應的第一階

14、段為堿基與水分子加成反應形成中間體的過程，第二階段為中間體脫氨形成產(chǎn)物的過程。在堿基與水分子加成反應的過程中，水分子中帶負電荷的O進攻堿基骨架上與氨基相連的C=N雙鍵中帶正電荷的C，水分子中帶正電荷的H進攻C=N雙鍵中帶負電荷的N，形成關鍵部分為四元環(huán)結構的過渡態(tài)，此加成反應屬于偶極加成反應。在過渡態(tài)中O-H o單鍵和C=N雙鍵中的π鍵部分斷裂，H…N σ單鍵和O…C之間的π鍵部分形成。過渡態(tài)中新形成的四元環(huán)平面與堿基骨架平面的夾角小于

15、90<'。>。由于水分子與堿基之間O…C鍵的部分形成，使得氨基N原子也偏離了堿基的骨架平面。過渡態(tài)的形成過程同時伴隨著原子間的電荷轉移及其幾何結構的變化。堿基與水分子形成中間體后，羥基H進攻氨基N原子形成第二個過渡態(tài)。在第二個過渡態(tài)中，由于H的靠近，NH<,3>分子的框架基本形成，氨基N與堿基C的鍵合作用被大大削弱：同時，羥基O-H鍵部分斷裂，C…0之間π鍵部分形成。在過渡態(tài)的形成過程中，隨著氨基的逐漸遠離，原羥基O也逐漸靠近堿基骨架平

16、面。胞嘧啶，腺嘌呤和鳥嘌呤與水分子加成反應的反應勢壘分別為258.2KJ/mol、200.6KJ/mol和202.7KJ/mol。顯然，嘌呤堿基與水分子的加成反應比胞嘧啶與水分子的加成反應容易發(fā)生。胞嘧啶，腺嘌呤和鳥嘌呤與水分子形成的中間體脫氨過程的反應勢壘分別為159.0KJ/mol、136.7KJ/mol和153.0KJ/mol，說明脫氨過程的勢壘要低于加成反應的勢壘，中間體脫氨過程的速度要比加成反應的速度快。也就是說，堿基與水分子

17、的加成反應是堿基水解脫氨損傷過程的控制步驟。過渡態(tài)的虛頻數(shù)值表明，中間體脫氨過程比堿基與水分子的加成反應有更大的隧道效應。 與單分子異構化過渡態(tài)的形成機制不同，加成反應過渡態(tài)的形成需要分子兩種運動模式的共同作用：分子振動使鍵得到活化，通過分子碰撞在合適的接觸模式形成加成反應的過渡態(tài)。 5．堿基的氧化脫氨損傷 亞硝酸氧化堿基脫氨的產(chǎn)物與堿基水解脫氨的產(chǎn)物相同，但亞硝酸氧化堿基脫氨的過程卻復雜得多，其原因來自兩個

18、方面：一是亞硝酸在溶液中的存在形式復雜，二是亞硝酸與堿基的反應的產(chǎn)物復雜。在中性溶液或生理條件下，亞硝酸溶液中NO<,2>、HNO<,2>和N<,2>O<,3>三種形式共存，但以HNO<,2>和N<,2>O<,3>為主，它們均可能參與堿基的氧化脫氨過程。在亞硝酸氧化堿基脫氨的過程中，第一步為HNO<,2>或N<,2>O<,3>參與反應生成堿基N-亞硝基衍生物(R-NH-NO)；第二步為N-亞硝基衍生物通過質子轉移形成堿基偶氮衍生物(R-

19、NN-OH)的過程；第三步為堿基偶氮衍生物脫除N<,2>形成烯醇式產(chǎn)物的過程；第四步為產(chǎn)物由烯醇式向酮式轉化的過程。其中第三步可以通過形成重氮鹽然后水解的反應途徑，也可以由堿基的偶氮衍生物直接脫除N<,2>形成烯醇式產(chǎn)物。亞硝酸氧化胞嘧啶脫氨過程的研究結果表明，HNO<,2>與胞嘧啶作用脫除一分子H<,2>O，其結合屬于偶極加成反應，形成的過渡態(tài)關鍵部分為四元壞結構。N<,2>O<,3>與胞嘧啶作用脫除一分子HNO<,2>，反應過程也屬

20、于偶極加成反應，形成的過渡態(tài)關鍵部分為五元環(huán)結構。過渡態(tài)的存在表明形成胞嘧啶N-亞硝基衍生物的過程為協(xié)同反應過程，即舊鍵的斷裂和新鍵的形成同時發(fā)生。從過渡態(tài)的幾何和電荷分布來看，原子間的電荷轉移是肯定的。HNO<,2>與胞嘧啶反應的勢壘大于N<,2>O<,3>與胞嘧啶反應的勢壘，這說明N<,2>O<,3>與堿基的作用比較容易發(fā)生，反應速度較快，應是形成胞嘧啶N-亞硝基衍生物的主要反應通道，N<,2>O<,3>應是亞硝酸參與胞嘧啶氧化脫氨

21、的主要形式。 胞嘧啶N-亞硝基衍生物通過分子內質子轉移形成胞嘧啶偶氮衍生物。其過渡態(tài)關鍵部分為四元環(huán)結構，該四元環(huán)基本上與堿基骨架共平面。過渡態(tài)中N-H單鍵和C=O雙鍵中π鍵的斷裂、O-H單鍵和N=N雙鍵中π鍵的形成同時發(fā)生。胞嘧啶N-亞硝基衍生物分子內質子轉移形成胞嘧啶偶氮衍生物的勢壘高于HNO<,2>和N<,2>O<,3>與胞嘧啶加成反應的勢壘。胞嘧啶偶氮衍生物直接脫N<,2>形成烯醇式次黃嘌呤的過渡態(tài)的關鍵部分也為四元

22、環(huán)結構，其中N2的結構框架已基本形成，N<,2>部分與堿基間的鍵合作用變得很弱；兩個N原子上的電荷向其它原子發(fā)生了大幅度轉移，已經(jīng)變得很小。此過程的反應勢壘為164.5KJ/mol。尿嘧啶通過分子內質子轉移由烯醇式向酮式轉化過程的過渡態(tài)與其它質子轉移過程過渡態(tài)的結構和性質大體類似，反應勢壘為142.5KJ/mol。在亞硝酸氧化胞嘧啶脫氨的整個過程中，N<,2.O<,3>與胞嘧啶加成的反應速度決定了胞嘧啶氧化脫氨損傷的速度；胞嘧啶偶氮衍生

23、物脫去N<,2>形成烯醇式次黃嘌呤的過程活化能最高，是形成次黃嘌呤的控制步驟。 研究結果表明，亞硝酸氧化腺嘌呤和鳥嘌呤脫氨過程的機制、過渡態(tài)的結構和性質及其動力學行為與亞硝酸氧化胞嘧啶脫氨過程類似。 6．水分子參與的質子轉移過程 堿基的異構化、水解脫氨和氧化脫氨過程均涉及分子內的質子轉移。由于這些反應的環(huán)境中均存在水，因此水分子可能參與分子內的質子轉移過程。我們研究了水分子參與胞嘧啶正常構型和胞嘧啶N-亞硝基衍生物分

24、子內質子轉移過程。結果表明，水分子可首先與胞嘧啶或胞嘧啶N-亞硝基衍生物形成氫鍵復合物，然后通過形成包含六元環(huán)結構的過渡態(tài)發(fā)生質子傳遞。在過渡態(tài)中，參與傳遞的兩個H原子與中心O的距離基本相等。由于這種傳遞過程不需要分子幾何的大幅度變化，需要的能量要小得多，因此反應勢壘大幅度降低。研究結果表明，在研究水分子參與堿基質子轉移的過程時，必須考慮氫鍵復合物的形成，否則，有可能低估反應的勢壘。水分子的參與可以大大加快分子內質子轉移過程的速度是因為

25、水分子參與了過渡態(tài)的形成，改變了質子轉移的反應途徑，使得胞嘧啶N-亞硝基衍生物的質子轉移由分子內的直接轉移過程變?yōu)橥ㄟ^水分子的質子交換傳遞過程。在這個過程中，水分子的作用相當于催化劑。根據(jù)物理化學原理，水分子的參與只能影響過程的動力學性質，而不可能改變過程的熱力學性質，因此質子轉移的化學平衡不受影響。 總之，通過對堿基異構化、水解脫氨和氧化脫氨等DNA損傷過程的理論研究，初步闡明了上述過程的分子機制和熱力學、動力學行為。這些結果