人源GM-CSF、Il-4基因串聯(lián)共表達重組克隆質(zhì)粒構(gòu)建與表達.pdf

1、目的
　　本課題以人白細胞介素-4（白介素-4，Interleukin-4，IL-4），粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)為模型細胞因子，建立并優(yōu)化人源性細胞因子的組合，并在真核細胞中穩(wěn)定性表達重組蛋白及其活性研究，這為多細胞因子在體外能夠共同表達提供了實驗素材和理論參考。構(gòu)建人GM-CSF、IL-4基因各自獨立和經(jīng)IRES

2、元件串聯(lián)的重組真核表達質(zhì)粒pGM-CSF、plL-4和pGM-CSF-IRES-IL-4，轉(zhuǎn)染細胞并經(jīng)過連接免疫熒光(indirectimmunofluorescence assay，IFA)及酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa)檢測其表達活性，為構(gòu)建永久表達細胞系做準備，同時人源細胞因子的體外表達及其誘生DC/CIK培養(yǎng)試劑盒的研發(fā)奠定了基礎。
　　方法
　　1

3、.引物和質(zhì)粒的設計與合成
　　依據(jù)GenBank上已經(jīng)公布了的人源性GM-CSF、IL-4基因的參考序列。分別設計了附加酶切位點的引物，酶切位點為XhoⅠ、BglⅡ和SalⅠ、MluⅠ，以及質(zhì)粒pMD15-T-CSF、 pMD15-T-IL-4。
　　2.重組質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4、pGM-CSF-IRES-IL-4的構(gòu)建
　　經(jīng)PCR擴增重組質(zhì)粒pMD15-T-CSF、pMD15-T-IL-4中的目的片段GM

4、-CSF、IL-4;利用0.8％瓊脂糖凝膠電泳進行回收、瓊脂糖凝膠回收純化好的的PCR產(chǎn)物，分別在各自的酶切位點處進行雙酶切，目的是回收兩條目的基因片段GM-CSF和IL-4;用T4連接酶分別與經(jīng)同步酶切的載體片段psT-△SG上進行連接，經(jīng)在固體培養(yǎng)皿上長出的優(yōu)勢抗性菌落的常規(guī)篩選，構(gòu)建單獨表達GM-CSF、IL-4基因的重組質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4;將目的基因與連接片段IRES分步連接到PsT-△SG載體上，經(jīng)在固體培養(yǎng)皿上長

5、出的優(yōu)勢抗性菌落的常規(guī)篩選，構(gòu)建pGM-CSF-IRES-IL-4真核表達載體。
　　3.重組質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4、 pGM-CSF-IRES-IL-4在CHO細胞中的瞬時表達
　　將重組質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4、pGM-CSF-IRES-IL-4在陽性脂質(zhì)體的介導下轉(zhuǎn)染CHO細胞，24小時后檢測GM-CSF、IL-4在CHO細胞中的表達。
　　4.IFA及Elisa檢測表達情況
　　對轉(zhuǎn)染的CH

6、O細胞用IFA和Elisa檢測人源GM-CSF、IL-4基因的蛋白質(zhì)表達。
　　結(jié)果
　　1.真核表達質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4、pGM-CSF-IRES-IL-4的構(gòu)建
　　成功構(gòu)建的三種真核表達質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4和pGM-CSF-IRES-IL-4，分別在經(jīng)菌落PCR，質(zhì)粒的PCR，瓊脂糖凝膠電泳雙酶切等方法鑒定后構(gòu)建成功。
　　2.IFA實驗及Elisa實驗檢測GM-CSF、IL-4表達結(jié)果

7、
　　經(jīng)過IFA的實驗結(jié)果顯示出，在熒光顯微鏡的下陽性表達的細胞大約在60％以上左右。Elisa的實驗結(jié)果顯示，GM-CSF、IL-4兩種基因在培養(yǎng)的CHO細胞當中能夠成功的表達。
　　結(jié)論
　　1.成功將人源基因GM-CSF、IL-4亞克隆入psT-△SG，分別構(gòu)建了融合基因真核表達質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4以及pGM-CSF-IRES-IL-4
　　2.人源細胞因子GM-CSF、IL-4在真核細胞中表達并