貝類DNA條形碼的篩選、驗證及應用.pdf

1、貝類種類繁多，分布范圍廣泛，棲息環(huán)境多種多樣，外部的形態(tài)結構以及生理解剖特點可以作為其分類的依據。然而，由于環(huán)境的變化，這些外部的分類特征具有極大的可塑性，這就給傳統的利用形態(tài)特征對貝類進行分類鑒定帶來了諸多困難。
　　DNA條形碼技術（DNA barcoding）是利用分子生物學技術對物種進行分類的方法，主要是通過PCR擴增和測序獲得一段標準同源序列，再將該序列進行多重序列比對和聚類分析，從而將某一個物種準確地歸為某一特定類群中

2、的分類鑒定技術。雖然關于COI、12S、16S、18S和28S等基因作為DNA條形碼的研究已有很多，但對條形碼數據分析總結的研究依然很少，本研究挑選了具有代表性的新腹足目、簾蛤目、貽貝目和珍珠貝目的種類進行條形碼數據分析，從而使實現條形碼標準基因的篩選驗證，以便應用。
　　首先，通過對新腹足目、簾蛤目、貽貝目、和珍珠貝目的COI、16S、18S和28S基因部分序列的分析，進行DNA條形碼標準基因的篩選。基于COI基因的序列分析發(fā)現

3、，科間差異在基本集中在30％-70%之間，屬間差異集中在20%-50%之間，種內差異集中在0.0%-7.5%之間，說明COI基因可以區(qū)到不同科、不同屬、甚至是同一物種，作為貝類DNA條形碼具有可行性。基于16S基因的部分序列我們發(fā)現，科間差異在35%-70%，屬間差異在10%-45%，種內差異在0.2%-1.5%之間，和COI基因一樣，16S也可以用來作為DNA條形碼來鑒別分類。而在18S和28S基因部分序列中，科間差異集中在10%-5

4、0%，屬間差異5%-15%，種內差異基本為0。由此可見，18S和28S基因在區(qū)分近緣物種方面不具優(yōu)勢，只適合作為高的分類階元的分子標記。
　　其次，收集了青島、煙臺、大連、?？?、廈門和寧波等地貝類，提取基因組DNA后，分別利用COI和16S通用引物進行PCR擴增，獲得COI和16S基因的部分序列，然后對序列進行遺傳多樣性分析。結果表明，共擴增出74條COI序列，其長度經剪切為578 bp，平均種間遺傳距離為0.958，種間的遺傳距

5、離大于種內的遺傳距離，構建的進化樹表明，所獲取的貝類明顯分為兩支，不同地理群體的同一物種首先明顯聚在一起，同一目的物種再聚在一起，所篩選的COI序列能夠將本研究中的物種全部區(qū)分開來。一共獲得68條不同貝類的16S部分序列，經剪切之后，長度均為421bp，平均種間遺傳距離為0.633。同COI序列的分析結果一樣，16S進化樹也可已將本研究中的大部分物種區(qū)分開來，雖然也分為明顯的兩支，但習見蛙螺（Bursa rana）和圓頂珠蚌（Unio

6、douglasiae）聚為一支，也不能區(qū)分開Solen lamarckii和Meretrix meretrix，說明16S在物種鑒別方面仍有一定的局限性。本研究結果表明，COI和16S均可以作為DNA條形碼來區(qū)分和鑒別物種。
　　最后，采用PCR技術，擴增了中國膠南、長島、蓬萊、榮成和韓國統營五個地理群體魁蚶樣本的COI、12S、18S和28S基因部分序列，并分析了五個魁蚶地理群體的遺傳多樣性和系統發(fā)育關系。經測序比對分析，分別獲

7、得67條776 bp的COI序列、72條443bp的12S序列、75條909 bp的18S序列和75條894bp的28S序列。序列比對結果表明，五個群體75個個體的COI序列中共檢測到521個多態(tài)位點，39種單倍型，單倍型多樣度為0.979，核苷酸多樣度為0.05632；12S序列中共檢測到292個多態(tài)位點，43種單倍型；在18S序列中，五個群體都表現出豐富的遺傳多樣性，共有74種單倍型，膠南群體多態(tài)位點有488個，平均核苷酸差異指數是