基于轉錄組分析的PUB蛋白與甘藍S-位點受體激酶的相互作用研究.pdf

1、自交不親和（Self-incompatibility，SI）是顯花植物防止自交、促進雜交，保持物種遺傳多樣性的重要機制之一。甘藍等蕓薹屬（Brassica）植物屬于典型孢子體型自交不親和植物，其自交不親和性由S位點（S-locus）上的復等位基因所控制。當自花授粉時，花粉落到柱頭上，花粉中SCR可與柱頭上SRK胞外域識別并特異性結合，引起SRK構象的變化和自體磷酸化，使其釋放結合在SRK激酶結構域的類硫氧還蛋白1/2（THL1/2），隨

2、后ARC1結合到SRK胞內激酶域上，并被磷酸化，ARC1是E3泛素連接酶，通過泛素化作用向下繼續(xù)傳導細胞信號，最終導致自交不親和。最近研究表明，在琴葉擬南芥（Arabidopsis lyrata）中通過反義抑制柱頭內的ARC1基因表達，只能部分地打破材料的不親和性；在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，ARC1直系同源基因是假性遺傳因子，僅僅轉入SRK-SCR基因后，擬南芥植株也能呈現出自交不親和性。由此說明ARC1可

3、能并非SRK唯一的下游信號蛋白，柱頭內可能存在其他未知底物與SRK作用，在柱頭內繼續(xù)傳遞SI信號。在甘藍自花授粉的過程中，柱頭內PUB蛋白的活性急劇增高，由此我們推測柱頭內可能存在其他的泛素蛋白與 SRK作用，因此前期對甘藍高代自交不親和A4的花期柱頭做了自花授粉0 min和自花授粉30 min兩種處理，提取了柱頭總RNA后進行轉錄組測序分析，發(fā)現25條表達差異明顯的PUB蛋白基因。我們挑取了4條表達差異最為明顯的PUB蛋白進行后續(xù)研究

4、，分別命名為 BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoSU11；隨后，運用qRT-PCR篩選出自花授粉后甘藍柱頭內基因表達水平發(fā)生變化的PUB蛋白。參照PUB蛋白基因的同源序列設計擴增引物，以甘藍A4 cDNA為模板來擴增基因片段，構建T載體克隆并測序。為探究這些泛素蛋白能否 SRK發(fā)生相互作用，我們利用酵母雙雜交技術和 GST pull-down技術檢測PUB蛋白和SRK胞內域之間的相互作用。
　　本研究主要內容包括：⑴在

5、轉錄組測序分析中，甘藍柱頭經過自花授粉0 min與自花授粉30 min兩種處理，BoSU03、BoSU05、BoSU07的基因表達量上升，BoSU11的基因表達量下降。為更精確的探究自花授粉后甘藍柱頭中泛素蛋白的時空表達特異性，我們以未授粉、自花授粉15 min、30 min、60 min的柱頭cDNA為模板，進行熒光定量PCR反應，實驗結果顯示，自花授粉后，ARC1的表達量有所下降，同時BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoS

6、U11的基因表達量相較于未授粉時也都在下降。我們注意到，BoSU11在熒光定量PCR中的基因表達量變化與在轉錄組測序分析中變化趨勢一致，但是BoSU03、BoSU05、BoSU07的基因表達量在熒光定量PCR中是下降的，與轉錄組測序分析中對應時間點變化趨勢不一致，這可能是因為轉錄組和熒光定量分析時獲取自花授粉0 min柱頭的時間點存在差異所導致。但是自花授粉后BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoSU11的基因差異表達進一步說明

7、了BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoSU11可能響應了自花授粉后柱頭內的自交不親和反應。⑵根據轉錄組測序所得的PUB基因片段序列，結合蕓薹屬基因數據庫和甘藍基因數據庫，設計擴增基因引物。我們對BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoSU11的全長CDS序列進行生物信息學分析，發(fā)現其二級結構主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構成；這4個PUB蛋白不含有跨膜結構域和核定位信號；在線分析這些泛素蛋白的理化性質和功能性位點，這4個PU

8、B蛋白氨基酸序列都含有多個N-糖基化位點、cAMP或cGMP依賴性磷酸化位點、蛋白激酶C磷酸化位點和酪蛋白Ⅱ磷酸化位點等功能性位點；BoSU07、BoSU11和ARC1一樣不僅具有ARM臂重復結構，還含有U-box結構域；但是BoSU03、BoSU05僅含有ARM臂重復結構域，而不具備U-box結構域。⑶因為SRK的胞內域與ARC1的U-box結構域之間沒有相互作用，而與其ARM臂重復結構域之間存在相互作用，故設計引物時摒除了泛素蛋白的

9、U-box區(qū)段，并在引物上下兩端分別加入限制性酶切位點，構建甘藍泛素蛋白基因、ARC1和SRK的酵母表達載體：pGADT7-BoSU03、pGADT7-BoSU05、pGADT7-BoSU07、pGADT7-BoSU11、 pGADT7-ARC1、pGBKT7-SRK，通過毒性檢測和自激活檢測，發(fā)現構建的表達載體對酵母細胞沒有毒性作用，也沒有自激活作用；將PUB蛋白、ARC1的酵母表達載體分別和pGBKT7-SRK共轉化酵母感受態(tài)AH1

10、09，觀察共轉化酵母在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/x-α-gal/25 mmol3-AT固體培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)，以此檢測這些泛素蛋白與SRK之間的相互作用。實驗結果顯示，BoSU03、BoSU05、BoSU07、BoSU11、和ARC1與SRK的組合在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/x-α-gal/25 mmol3-AT固體培養(yǎng)基上能夠生長，且顯現出藍色反應，表明BoSU03、BoSU05、BoSU07、

11、BoSU11可能與SRK發(fā)生相互作用。⑷依據共沉淀法鑒定蛋白質相互作用原理，通過研究 Promega蛋白純化試劑盒原理來進行蛋白質間相互作用的檢測。利用 pET43.1a作為表達載體表達BoSU07和BoSU11，利用pET43.1a-BoSU07、pET43.1a-BoSU11融合蛋白序列中的6×His標簽與 Ni+結合，結合的復合物作為誘餌蛋白，把體外表達的pGEX-4T-1-SRK融合蛋白作為靶蛋白，pET43.1a-BoSU07

12、、pET43.1a-BoSU11上結合的Ni+，孵育后利用其與磁力架吸附性將誘餌蛋白和靶蛋白的復合體純化出來。SDS-PAGE試驗結果顯示，pET43.1a-BoSU07和pET43.1a-BoSU11融合蛋白都能夠與pGEX-4T-1-SRK融合蛋白相互結合形成穩(wěn)定的復合體，而與Ni+一起被洗脫下來，表明BoSU07、BoSU11都能與SRK胞內域發(fā)生相互作用。我們推測BoSU07、BoSU11作為PUB蛋白家族成員，很有可能通過與S