重組人轉(zhuǎn)氨酶標準物質(zhì)及人巨細胞病毒IgG抗體國家參考品的研制.pdf

1、目的
　　通過采用基因重組的技術(shù)表達的谷丙轉(zhuǎn)氨酶蛋白和谷草轉(zhuǎn)氨酶蛋白研制人谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶混合標準品,用于臨床檢驗實驗室以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒的質(zhì)量控制。通過以正常人的血清為原料研制人巨細胞病毒IgG抗體參考品,用于臨床檢驗實驗室和人巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒的質(zhì)量控制。
　　方法
　　一、重組人轉(zhuǎn)氨酶標準物質(zhì)的研制
　　1、目的基因的獲得。從NCBI網(wǎng)站上查詢?nèi)斯缺D(zhuǎn)氨酶蛋白和人谷草轉(zhuǎn)氨酶蛋

2、白的序列,根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子表,對查找的序列進行優(yōu)化,并將優(yōu)化成功的基因序列送生物公司合成。
　　2、表達菌株構(gòu)建。通過雙酶切的方法將合成的基因從復(fù)制型載體上切下,連接入表達載體PRSF-Duet,構(gòu)建出表達載體PRSF-ALT和PRSF-AST,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中,構(gòu)建出基因工程菌株。
　　3、蛋白的表達、純化及活性測定。用IPTG誘導(dǎo)蛋白的表達,對蛋白誘導(dǎo)表達過程中所需的IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度進行探索,并對表

3、達的蛋白通過親和層析和分子篩層析的方法進行純化,獲得人谷丙轉(zhuǎn)氨酶蛋白和人谷草轉(zhuǎn)氨酶蛋白,并對獲得的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶蛋白進行活性測定。
　　4、基質(zhì)血清的處理。對收集的正常人血清進行血源篩查后,對合格血清進行去纖維化處理以制備轉(zhuǎn)氨酶的基質(zhì)。
　　5、標準品的制備。將制備的谷丙轉(zhuǎn)氨酶蛋白和谷草轉(zhuǎn)氨酶蛋白按一定濃度加入基質(zhì)血清中,混勻,并分裝至1.5mL的凍存管中完成標準品的制備。
　　6、標準品的稀釋。同時用3份轉(zhuǎn)氨

4、濃度不同的血清和生理鹽水對標準品進行稀釋,將稀釋后的樣品進行測定。統(tǒng)計分析測定結(jié)果。
　　7、標準品的評價。對制備的標準品進行均勻性和穩(wěn)定性的評價。
　　8、標準物質(zhì)的定值以及不確定度的評估。將研制的待測標準物質(zhì)通過三家轉(zhuǎn)氨酶參考實驗室,用IFCC參考方法對轉(zhuǎn)氨酶標準品進行定值。對研制的轉(zhuǎn)氨酶標準品的不確定度進行評估。
　　二、人巨細胞病毒IgG抗體參考品的研制
　　9、參考品原料的獲得。將收集的血漿進行去纖維化

5、處理并進行血源篩查試驗,用人巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒對收集的血清進行篩選,篩選出10份人巨細胞病毒IgG抗體陽性血清和5份人巨細胞病毒IgG抗體陰性血清。
　　10、參考品原料的確認和復(fù)核。用間接免疫熒光和Westernblot的方法對參考品原料進行確認,用國內(nèi)外的試劑盒對參考品原料進行復(fù)核。
　　11、參考品的驗證。用國內(nèi)外六家公司生產(chǎn)的試劑盒對制備的參考品從準確性、特異性以及靈敏度三個方面進行評價。
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6、、參考品穩(wěn)定性的考察。用人巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒對參考品在不同條件下的穩(wěn)定性進行考察。
　　結(jié)果
　　通過對人谷丙轉(zhuǎn)氨酶基因和人谷草轉(zhuǎn)氨酶基因序列進行優(yōu)化,并將轉(zhuǎn)氨酶基因克隆至PRSF-Duet載體中,將載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21菌體中,成功表達了人谷丙轉(zhuǎn)氨酶蛋白和谷草轉(zhuǎn)氨酶蛋白,通過蛋白的純化得到了活性為80000U/L的谷丙轉(zhuǎn)氨酶蛋白和活性為136000U/L的谷草轉(zhuǎn)氨酶蛋白,將轉(zhuǎn)氨酶蛋白制成轉(zhuǎn)氨酶標準品,通過對

7、轉(zhuǎn)氨酶標準品進行評價,得出轉(zhuǎn)氨酶標準品均勻性良好、穩(wěn)定性良好。最后對標準品進行定值和不確定度評估,得出谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性為1020.5U/L,不確定度為194.40U/L。谷草轉(zhuǎn)氨酶活性為792.9U/L,不確定度為78.37U/L。
　　用試劑盒篩選出人巨細胞病毒IgG抗體的陽性血10份,陰性血5份,用兩家不同的試劑盒對篩選的血清進行復(fù)核,結(jié)果符合預(yù)期,用免疫印跡和免疫熒光實驗對篩選的血清進行確認,結(jié)果符合要求。將確認正確的血清制成