簡介：背景血管性癡呆（VULARDEMENTIAVAD）是由各種腦血管疾病引起的智能障礙綜合征，多繼發(fā)于腦動脈粥樣硬化、腦卒中等，在老齡人群癡呆中的發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病ALZHEIMER’SDISEASEAD。隨著人口老齡化和心血管疾病的高發(fā)，VAD的患病率在近十年內(nèi)將持續(xù)升高。VAD的發(fā)病機(jī)制與缺血性腦損傷所致的神經(jīng)元退行性變、神經(jīng)元凋亡和壞死等相關(guān)，然而更深入的細(xì)胞學(xué)和分子學(xué)機(jī)制尚不明確。臨床治療原則主要是控制危險因素，包括控制血壓、血糖、血脂、戒煙、抗血小板聚集藥物治療等預(yù)防腦卒中的發(fā)生，由于目前缺乏治療VAD的特異性藥物，臨床研究證實(shí)AD有效的藥物雖然能在一定程度上緩解VAD癥狀，但治療效果不佳。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BRAINDERIVEDNEUROTROPHICFACTBDNF是神經(jīng)生長因子家族中表達(dá)最為豐富的成員，不僅對神經(jīng)元正常功能的維持發(fā)揮作用，而且對神經(jīng)元損傷后的修復(fù)也發(fā)揮著重要的作用，如促進(jìn)神經(jīng)元的存活、生長、分化和可塑性等。研究發(fā)現(xiàn)BDNF能調(diào)節(jié)GAP43及突觸素的表達(dá)。GAP43蛋白是一種膜相關(guān)磷蛋白，主要表達(dá)于發(fā)育或再生軸突的生長錐內(nèi)，因此可作為神經(jīng)再生的標(biāo)志【1】。突觸素是一種與突觸囊泡相連的磷酸蛋白，其為突觸的特異性標(biāo)記物之一，能反應(yīng)出突觸的含量及分布【2】。三者在神經(jīng)發(fā)育及可塑性中發(fā)揮著重要作用。文拉法辛是一種新型的抗抑郁藥，其主要藥理機(jī)制為抑制神經(jīng)突觸前膜對5TH及去甲腎上腺素的再攝取【3】。值得一提的是，已經(jīng)有研究顯示文拉法辛可提高抑郁患者腦內(nèi)BDNF蛋白的含量，從而改善患者的認(rèn)知功能。然而，通過使用鹽酸文拉法辛提高血管性癡呆患者腦內(nèi)BDNF蛋白的含量，從而促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)改善患者認(rèn)知功能還未有研究報道，因此探索鹽酸文拉法辛對血管性癡呆的療效及作用機(jī)制的研究具有重要意義。目的本課題以大鼠永久性雙側(cè)頸總動脈阻斷（BCCAO）建立血管性癡呆模型，觀察大鼠BCCAO術(shù)后認(rèn)知功能改變、神經(jīng)可塑性改變的發(fā)生機(jī)制，并觀察抗抑郁藥物鹽酸文拉法辛對血管性癡呆大鼠腦組織BDNF，GAP43突觸素表達(dá)的影響及其行為學(xué)作用，探討鹽酸文拉法辛對血管性癡呆大鼠大腦神經(jīng)可塑性和認(rèn)知功能影響以及其潛在作用機(jī)制。方法1動物分組及血管性癡呆動物模型建立11分組180只WISTAR大鼠隨機(jī)分成六組，文拉法辛1組（VENLAFAXINE5MGKGDGROUP，N30），文拉法辛2組（VENLAFAXINE15MGKGDGROUP，N30），文拉法辛3組（VENLAFAXINE20MGKGDGROUP，N30）血管癡呆大鼠（VADGROUPN30安慰劑組（VADPLACEBOGROUP，N30），假手術(shù)組（SHAMOPERATEDGROUP，SOGROUP，N30）。12建立大鼠血管性癡呆模型（BILATERALCOMMONCAROTIDARTERIESOCCLUSION，BCCAO）10％水合氯醛腹腔注射麻醉后，大鼠頸前正中行一縱形切口，鈍性分離皮下組織，肌肉暴露雙側(cè)頸總動脈和迷走神經(jīng)，鈍性分離雙側(cè)頸總動脈和迷走神經(jīng)并用1號非吸收性絲線對頸總動脈進(jìn)行雙重結(jié)扎，假手術(shù)組大鼠只分離頸總動脈及迷走神經(jīng)但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈。13藥物干預(yù)文拉法辛1組，文拉法辛2組，文拉法辛3組及安慰劑組大鼠在BCCAO術(shù)后24小時開始灌胃給藥，每日固定于上午9001000給藥。分別在1周，2周，3周，4周處死大鼠。假手術(shù)組及血管癡呆組大鼠BCCAO術(shù)后不給于任何藥物干預(yù)。2MRIS水迷宮實(shí)驗(yàn)行為學(xué)觀察觀察血管癡呆大鼠及文拉法辛對BCCAO術(shù)后大鼠空間學(xué)習(xí)、記憶的干預(yù)作用。假手術(shù)組，安慰劑組，血管癡呆組，文拉法辛1組，文拉法辛2組，文拉法辛3組用藥1周，2周，3周，4周后進(jìn)行MRIS水迷宮實(shí)驗(yàn)，記錄定位航行試驗(yàn)中大鼠找到逃生平臺的平均逃避潛伏期（MEANESCAPELATENCYTIMEMELT）和空間探索試驗(yàn)中大鼠在目標(biāo)象限的平均搜尋時間（MEANTIMEINTARGETQUADRANT，MTITQ）以此評估大鼠的運(yùn)動、空間學(xué)習(xí)、記憶能力。3文拉法辛干預(yù)后大鼠海馬、皮層的神經(jīng)病理學(xué)觀察31腦組織取材、石蠟包埋和制片BCCAO術(shù)后第二天開始給予文拉法辛、安慰劑灌胃，分別在用藥1周，2周，3周，4周后從假手術(shù)組、血管癡呆組、安慰劑組和文拉法辛組中各取5只大鼠，水迷宮測試后進(jìn)行過度麻醉后經(jīng)心臟灌注固定，斷頭取前腦及海馬區(qū)，自視交叉后3MM處冠狀位切取約3MM厚度腦組織，海馬包含在內(nèi)。梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋。32神經(jīng)病理學(xué)染色石蠟組織作冠狀位連續(xù)切片（2ΜM），蘇木素伊紅染色后在光學(xué)顯微鏡高倍鏡（400）下觀察。4免疫組織化學(xué)檢測大鼠海馬CA1區(qū)、皮層神經(jīng)元BDNF，GAP43突觸素蛋白的表達(dá)觀察慢性腦缺血皮層區(qū)及海馬區(qū)CA1區(qū)神經(jīng)元BDNF、GAP43、突觸素蛋白表達(dá)的動態(tài)變化及腦缺血后給予文拉法辛干預(yù)對大鼠海馬CA1區(qū)、皮層神經(jīng)元BDNF、GAP43、突觸素蛋白表達(dá)水平的影響。石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化和高壓修復(fù)后，以ENVISION酶免疫組化法檢測海馬CA1區(qū)、皮層神經(jīng)元BDNF、GAP43、突觸素的表達(dá)。5統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用上海欣軟信息科技有限公司開發(fā)的SUPERMAZE動物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)分析MRIS水迷宮實(shí)驗(yàn)過程中采集到的大鼠運(yùn)動軌跡；應(yīng)用IMAGEPROPLUS圖文分析系統(tǒng)采集組織病理、免疫組化圖片及進(jìn)行免疫組化平均光密度分析。應(yīng)用SPSS130統(tǒng)計軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用KOLMOGOVSMIRNOV正態(tài)性檢驗(yàn)和LEVENE方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Χ±S）表示；MRIS水迷宮實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素重復(fù)測量的方差分析，首先對重復(fù)測量數(shù)據(jù)進(jìn)行球性檢驗(yàn)（MAUCHLY’STESTOFSPHERICITY。當(dāng)資料不滿足MAUCHLY’S球?qū)ΨQ性檢驗(yàn)時采用GREENHOUSEGEISSER法校正自由度；其余正態(tài)分布資料方差齊性采用ANOVA，方差不齊采用WELCH校正檢驗(yàn)，多重比較方差齊性采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用DUNT’ST3檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計學(xué)結(jié)果以P結(jié)果1MRIS水迷宮行為學(xué)分析結(jié)果11在定位航行試驗(yàn)中血管性癡呆組、假手術(shù)組、文拉法辛1組，文拉法辛2組，文拉法辛3組以及安慰劑組大鼠的平均游泳速度無統(tǒng)計學(xué)差異（P005），提示BCCAO誘導(dǎo)的血管性癡呆大鼠不存在明顯運(yùn)動功能障礙。12在定位航行試驗(yàn)中VAD大鼠14周的平均逃避潛伏期（MELT）較假手術(shù)組大鼠明顯延長（P2海馬CA1區(qū)、皮層組織病理學(xué)觀察結(jié)果在BCCAO術(shù)后1周、2周、3周和4周，血管性癡呆組大鼠皮層及海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變性、壞死隨缺血時間延長逐漸加重，VAD組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元計數(shù)進(jìn)行性減少（P3海馬CA1區(qū)、皮層BDNFGAP43突觸素免疫組化檢測結(jié)果31免疫組化顯示海馬CA1區(qū)及皮層區(qū)神經(jīng)元胞漿及胞核內(nèi)BDNF蛋白在術(shù)后1周表達(dá)量出現(xiàn)短暫性的增高（圖333C1圖333D1，P32BCCAO術(shù)后給予文拉法辛干預(yù)，文拉法辛處理組大鼠海馬、皮層神經(jīng)元BDNF蛋白在用藥后24周表達(dá)量均較安慰劑組增多（圖337F2F4P結(jié)論1雙側(cè)頸總動脈阻斷術(shù)后14周，血管性癡呆大鼠在MRIS水迷宮實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯空間學(xué)習(xí)和記憶缺損，該癥狀與海馬、皮層缺血性神經(jīng)損傷相伴隨，隨腦缺血時間延長進(jìn)行性加重。2BCCAO術(shù)后海馬、皮層BDNF、GAP43、突觸素在腦缺血早期出現(xiàn)短暫性表達(dá)增高，可能為中樞神經(jīng)系統(tǒng)對缺血性腦損傷后代償性的神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。3BCCAO術(shù)后早期給予文拉法辛3周及4周后，VAD大鼠在MRIS水迷宮實(shí)驗(yàn)中的平均逃避潛伏期縮短，在目標(biāo)象限的平均搜索時間有所延長，提示5MGKGD及15MGKGD的鹽酸文拉法辛可改善大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶功能。4BCCAO術(shù)后早期給予文拉法辛干預(yù)24周后，皮層及海馬區(qū)BDNF表達(dá)均較安慰劑對照組增多；皮層區(qū)GAP43的表達(dá)量較安慰劑組明顯增多，推測文拉法辛改善缺血性腦損傷后認(rèn)知障礙的機(jī)制可能與5HT調(diào)整BDNF表達(dá)，兩者共同促進(jìn)神經(jīng)元存活，促進(jìn)神經(jīng)重塑有關(guān)。

簡介：點(diǎn)擊查看更多S100β蛋白在心臟瓣膜手術(shù)圍術(shù)期的變化及其與術(shù)后認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：南方醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文慢病毒介導(dǎo)的TGFΒ1SIRNA對新生小鼠高氧肺損傷保護(hù)作用的體內(nèi)初步研究姓名段江申請學(xué)位級別博士專業(yè)兒科學(xué)指導(dǎo)教師封志純20090512中文摘要性。設(shè)計的序列經(jīng)體外退火形成雙鏈寡核苷酸，將其與以BAMHL／XHOL酶切后的載體PRNATU62連接，轉(zhuǎn)化DH5A感受態(tài)細(xì)胞，小量抽提質(zhì)粒后測序鑒定。得到的陽性質(zhì)粒以XHOL和XBAL雙酶切，回收其中7010BP條帶作為載體。載體PKGRFP以XHOL和NHEL雙酶切，回收其中1262BP作為目的基因片段純化，以上兩片段連接重組，轉(zhuǎn)化DH5A感受態(tài)細(xì)胞，抽提質(zhì)粒。以BAMHL單酶切鑒定，釋放出600BP條帶為正確的克隆質(zhì)粒，即為重組慢病毒載體。將慢病毒包裝系統(tǒng)三質(zhì)粒和重組慢病毒載體混合，導(dǎo)入293T細(xì)胞，包裝成病毒后，采集病毒上清液，采用系列梯度稀釋法，G418藥物篩選測定病毒滴度。同法構(gòu)建陰性干擾慢病毒載體。將包裝好的病毒轉(zhuǎn)染AECII，分為干擾組，陰性干擾組和空白對照組3組，每組5復(fù)孔，干擾組和陰性干擾組分別加入構(gòu)建的干擾載體和陰性干擾載體，空白對照組加入等量不含病毒的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染96H后提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，以WESTERNBLOT檢驗(yàn)TGF131蛋白表達(dá)驗(yàn)證慢病毒載體干擾效率。并分別取3實(shí)驗(yàn)組AECII細(xì)胞滴片，以TGF131多克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔IGG為二抗，間接免疫熒光法觀察TGFB1表達(dá)情況。采集的數(shù)據(jù)用SPSSL30統(tǒng)計軟件行單因素方差分析，多重比較用SNK法。結(jié)果測序結(jié)果顯示，TGF131SHRNA干擾序列成功插入PRNATU62載體，該重組質(zhì)粒與PKGRFP載體重組、轉(zhuǎn)化、氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆，酶切驗(yàn)證質(zhì)粒重組成功。在293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝，收集上清液，系列梯度稀釋法檢測病毒懸液的滴度，G418藥物篩選，測定慢病毒滴度為523X108TU／ML。WESTERNBLOT檢驗(yàn)TGF131蛋白表達(dá)，干擾組明顯低于陰性干擾組氏005和空白對照組尸O05，抑制效率為736％。間接免疫熒光顯示陰性干擾組和空白對照組的熒光則呈較強(qiáng)表達(dá)，而干擾組的綠色熒光表達(dá)則明顯減弱。結(jié)論成功構(gòu)建小鼠TGFP1SHRNA慢病毒載體PU62TGFIUPLENTI。其可有效抑制AECIITGFPL蛋白的表達(dá)。關(guān)鍵詞轉(zhuǎn)化生長因子P1小分子干擾RNA慢病毒載體小鼠第二章活體內(nèi)沉默TGFILL基因?qū)π∈蠓闻莅l(fā)育的影響IL

簡介：分類號R373密級不保密UDC610學(xué)校代碼11065碩士學(xué)位論文EB病毒BARF1及其變異型基因改變鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為機(jī)制的初步研究沈智超指導(dǎo)教師王云教授學(xué)科專業(yè)名稱病原生物學(xué)論文答辯日期201562MECHANISMSOFEPSTEINBARRVIRUSENCODEDBARF1ITSVARIANTTOAFFECTTHEBIOLOGICALBEHAVISOFNASOPHARYNGEALCARCINOMACELLLINESABSTRACTBACKGROUNDOBJECTIVETHEEPSTEINBARRVIRUSEBVENCODEDBARF1GENEISCONSIDEREDASONEOFTHEVIRUSONCOGENEITSTRANSFMATIONROLEHASBEENDEMONSTRATEDINVARIOUSCELLLINESBARF1ISFREQUENTLYEXPRESSEDINNASOPHARYNGEALCARCINOMANPCINDICATINGTHATBARF1GENEMAYPLAYANIMPTANTROLEINNPCOURPREVIOUSSTUDYSHOWEDTHATBARF1ITSVARIANTV29AINCREASETHEANTIAPOPTOSISMIGRATIONABILITIESOFNPCCELLLINECNE1THISSTUDYAIMSTOFURTHEREXPLETHEONCOGENICFUNCTIONSOFBARF1ITSVARIANTINEBVNEGATIVENPCCELLLINESHONE1INVESTIGATETHEMECHANISMSOFBARF1TOAFFECTTHEBIOLOGICALBEHAVISOFNPCCELLLINESMETHODSTHECELLBIOLOGICALBEHAVIANALYSISWERECONDUCTEDINCLUDINGMTTASSAYCOLONYFMATIONASSAYANTIAPOPTOSISASSAYCELLMIGRATIONINVASIONASSAYINVIVOTUMIGENICITYTESTINPROTOTYPEBARF1V29AVARIANTBARF1TRANSFECTEDCELLSUNDERTHECONTROLOFLENTIVIRUSVECTTRANSFECTIONGROUPTHEDIFFERENTIALLYEXPRESSEDGENESBETWEENTHEBARF1TRANSFECTEDCELLSTHEVECTTRANSFECTEDCELLSWEREDETECTEDBYCDNAMICROARRAYTECHNIQUEFUNCTIONALONTOLOGIESPATHWAYANALYSISFTHEBARF1MODULATEDGENESWASAPPLIEDTHEBARF1RELATEDCANCERPATHWAYSKEYGENESWEREVALIDATEDINNPCCELLLINESXENOGRAFTTUMSRESULTS1EXPRESSIONOFPROTOTYPEBARF1VARIANTBARF1INHONE1CELLLINESINCREASEDCELLPROLIFERATIONCOLONYFMATIONABILITYP005ENHANCEDTHECELLANTIAPOPTOSISMIGRATIONINVASIONABILITYP005NODIFFERENCEWASFOUNDBETWEENPROTOTYPEVARIANTBARF1EXPRESSINGCELLS2BARF1EXPRESSIONINHONE1CELLSDIDNOTENHANCETHEINVIVOTUMIGENICITYINNUDEMICE3THEPROTOTYPEBARF1VARIANTBARF1TRANSFECTEDCELLSDEMONSTRATEDSIMILAREXPRESSIONPROFILETHEYSHOWED317DIFFERENTIALLYEXPRESSEDGENESCOMPAREDWITHVECTTRANSFECTEDCELLSINCLUDING94UPREGULATEDGENES223DOWNREGULATEDGENESTHEBARF1MODULATEDGENESWEREINVOLVEDINCELLADHESIONCELLSIGNALTRANSDUCTIONCELLAPOPTOSISCELLPROLIFERATIONCELLMIGRATIONINVASIONPARTICIPANTEDINMANYPATHWAYSSUCHASCYTOKINECYTOKINERECEPTINTERACTIONERBBSIGNALINGPATHWAYPATHWAYSINCANCER

簡介：安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文人巨細(xì)胞病毒先天性感染胎鼠大腦皮質(zhì)鈣調(diào)素基因MRNA表達(dá)的研究姓名陳貴海申請學(xué)位級別碩士專業(yè)病原生物學(xué)指導(dǎo)教師王明麗龔蘊(yùn)珍199961室塑墾型查堂堡主嬰莖生蘭些堡蘭一胞的胞核及胞漿亦有高密度表達(dá)，陽性細(xì)胞的突起中亦有弱信號存在結(jié)論本研究結(jié)果提示先天性感染HCMV胎鼠大腦皮質(zhì)鈾C(jī)AMMRNA表達(dá)量明顯增加，且神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)，并與感染劑量有依賴關(guān)系。提示CAMMRNA表達(dá)增高可能直接參與了HCMV先天性感染腦損害的過程。|關(guān)鍵詞巨細(xì)胞病毒先天性感染短藉莉聚合酶鏈反應(yīng)原位雜交鈣調(diào)素基因表達(dá)信使核糖核酸鼠大腦皮質(zhì)

簡介：目的干擾素（INTERFERON，IFN）是目前慢性乙型病毒性肝炎CHRONICHEPATITISB，CHB和慢性丙型病毒性肝炎CHRONICHEPATITISC，CHC抗病毒治療過程中一個重要的組成部分。在抗乙型肝炎病毒藥物中，IFN與核苷（酸）類似物相比具有療程短、停換藥方便等優(yōu)勢在慢性丙型病毒肝炎治療中，IFN聯(lián)合利巴韋林還是其標(biāo)準(zhǔn)治療方案。雖然目前已有數(shù)十種干擾素被發(fā)現(xiàn)，然而在中國僅有隸屬于Ⅰ型干擾素的IFNΑ應(yīng)用到病毒性肝炎的抗病毒治療中。但是，在此治療過程中僅有30％40％CHB患者能達(dá)到E抗原的血清學(xué)轉(zhuǎn)換，約有60％的患者對其治療應(yīng)答不佳而且有50％60％的基因1型CHC患者無法得到持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答SUSTAINEDVIROLOGICALRESPONSE，SVR。與此同時，由于IFNΑ的諸多副作用，部分患者在治療過程中還因?yàn)閲?yán)重的副反應(yīng)而終止治療。近期研究發(fā)現(xiàn)泛素特異性蛋白酶18UBIQUITINSPECIFICPROTEASE18，USP18是IFNΑ療效的重要影響因子，并且進(jìn)一步研究證實(shí)USP18是IFNΑ治療效果的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子。IFNΛ是最新發(fā)現(xiàn)的一類新型干擾素，隸屬于Ⅲ型干擾素與IFNΑ類似它也是通過激活JAKSTAT（JANUSACTIVATEDKINASESIGNALTRANSDUCERACTIVATOFTRANION，JAKSTAT）通路并調(diào)控一系列抗病毒蛋白如雙鏈RNA依賴的蛋白激酶RPKR和抗黏病毒蛋白MIXOVIRUSRESISTANCEPROTEINA，MXA來發(fā)揮抗病毒作用。最新體外研究發(fā)現(xiàn)在IFNΑ應(yīng)答不佳的細(xì)胞中IFNΛ仍然可以發(fā)揮抗病毒作用。關(guān)于USP18在IFNΑ的抗病毒通路中的研究進(jìn)展很多，但對于其在IFNΛ的抗病毒信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的影響報道甚少。本研究旨在探討USP18對IFNΑ和IFNΛ抗病毒信號通路的不同影響及其臨床意義。方法復(fù)蘇HUH7細(xì)胞用含10％胎牛血清、1％青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基在5％CO2，37℃條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后分為空白對照組、IFNΑ實(shí)驗(yàn)組和IFNΛ實(shí)驗(yàn)組。1IFNΑ實(shí)驗(yàn)組給予IFNΑ2A20IUML，IFNΛ實(shí)驗(yàn)組給予IFNΛ110NGML進(jìn)行刺激，空白對照組常規(guī)培養(yǎng)并加入等體積無菌生理鹽水，分別于6H，12H，24H，48H后收細(xì)胞。2空白對照組常規(guī)培養(yǎng)并加入無菌生理鹽水，IFNΑ實(shí)驗(yàn)組給予IFNΑ2A（20IUML），IFNΛ實(shí)驗(yàn)組給予IFNΛ110NGML進(jìn)行刺激12小時，然后三組細(xì)胞用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗三遍后重新置入新鮮的無干擾素培養(yǎng)基中培養(yǎng)16H，然后分別再次給予無菌生理鹽水、IFNΑ2A（20IUML）和IFNΛ1（10NGML）刺激12H后收細(xì)胞。3空白對照組常規(guī)培養(yǎng)并加入無菌生理鹽水，IFNΑ實(shí)驗(yàn)組給予IFNΑ2A（20IUML），IFNΛ實(shí)驗(yàn)組給予IFNΛ1（10NGML）進(jìn)行刺激12小時，然后三組細(xì)胞用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗三遍后重新置入新鮮的無干擾素培養(yǎng)基中培養(yǎng)16H，然后再分別給予無菌生理鹽水、IFNΛ1（10NGML）和IFNΑ2A（20IUML）刺激12H后收細(xì)胞。實(shí)時熒光定量聚合酶連反應(yīng)REALTIMEQUANTITATIVEPOLYMERASECHAINREACTION，RTQPCR法檢測HUH7細(xì)胞USP18、STAT1、PKR和MXA的MRNA表達(dá)水平。WESTERNBLOT檢測USP18、PSTAT1、STAT1、PKR及MXA的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果1不同干擾素刺激時間6H，12H，24H，48H各組HUH7細(xì)胞指標(biāo)的變化11各組細(xì)胞USP18的表達(dá)變化隨著干擾素刺激時間的延長，IFNΑ實(shí)驗(yàn)組和IFNΛ實(shí)驗(yàn)組HUH7細(xì)胞內(nèi)USP18MRNA的表達(dá)增加，但I(xiàn)FNΑ組比IFNΛ組增加更為明顯且在24H、48HUSP18MRNA的表達(dá)明顯高于IFNΛ組533±047VS460±042，541±046VS476±078，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜001）。此外，IFNΑ組和IFNΛ組細(xì)胞的USP18MRNA均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜001。隨著干擾素刺激時間的延長，IFNΑ組和IFNΛ組HUH7細(xì)胞內(nèi)USP18蛋白的表達(dá)也開始增加，IFNΑ組比IFNΛ組增加更明顯且在48H時USP18蛋白的升高明顯大于IFNΛ組（161±004VS146±003），差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜005。12不同刺激時間各組細(xì)胞STAT1、PKR和MXA的表達(dá)變化以及STAT1磷酸化蛋白的變化121隨著干擾素刺激時間的延長，IFNΑ組和IFNΛ組HUH7細(xì)胞內(nèi)STAT1、PKR和MXAMRNA表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢，并且在刺激12H時IFNΑ組STAT1、PKR和MXAMRNA表達(dá)水平達(dá)到最高，且明顯高于IFNΛ組561±044VS484±033542±037VS468±015382±035VS323±046，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜001）。隨后，IFNΑ組的STAT1、PKR和MXAMRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)降低趨勢，而IFNΛ組的表達(dá)繼續(xù)上升并在24H時達(dá)到高峰，并且高于IFNΑ組530±015VS595±037，481±043VS581±040，337±046VS463±062，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜001）。此后兩組的STAT1、PKR和MXAMRNA表達(dá)開始下降，但48HIFNΛ組仍高于IFNΑ組。各組HUH7細(xì)胞STAT1、PKR和MXA蛋白水平變化與MRNA表達(dá)變化類似。122隨著干擾素刺激時間的延長，IFNΑ組和IFNΛ組HUH7細(xì)胞內(nèi)STAT1磷酸化蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢。IFNΑ組的STAT1磷酸化蛋白表達(dá)水平高于IFNΛ組，并且在刺激12H時IFNΑ組STAT1磷酸化蛋白表達(dá)水平達(dá)到最高，且明顯高于IFNΛ組（119±002VS063±002），差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜005。隨后，IFNΑ組STAT1磷酸化蛋白表達(dá)開始下降，IFNΛ組的表達(dá)繼續(xù)上升并在24H時達(dá)到高峰，并且高于IFNΑ組071±001VS125±002，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜005。2三組細(xì)胞分別給予無菌生理鹽水、IFNΑ2A（20IUML）、IFNΛ110NGML進(jìn)行刺激12H后更換無干擾素的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)16H后再次給予無菌生理鹽水、IFNΑ2A20IUML、IFNΛ1（10NGML）刺激12H后細(xì)胞各個指標(biāo)的變化。21各指標(biāo)MRNA表達(dá)的變化IFNΑ組的USP18MRNA表達(dá)高于IFNΛ組404±039VS325±026，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜005。IFNΑ組STAT1、PKR、MXA的MRNA表達(dá)均低于IFNΛ組471±028VS654±026，371±025VS541±032，291±023VS431±019，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜005）。22各指標(biāo)蛋白表達(dá)水平的變化IFNΑ組的USP18蛋白表達(dá)高于IFNΛ且193±015VS182±014，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜005。IFNΑ組STAT1、PSTAT1、PKR、MXA的蛋白表達(dá)均低于IFNΛ組分別為113±016VS161±017，112±018VS149±015，131±013VS191±016，109±019VS159±010，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜005）。3三組細(xì)胞分別給予無菌生理鹽水、IFNΑ2A（20IUML）、IFNΛ1（10NGML）進(jìn)行刺激12H后更換無干擾素的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)16H后再給予無菌生理鹽水、IFNΛ110NGML、IFNΑ2A（20IUML）刺激12H后細(xì)胞各個指標(biāo)的變化。31各指標(biāo)MRNA表達(dá)的變化IFNΑ組的USP18MRNA表達(dá)與IFNΛ組（354±028VS346±031）相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義P＞005。IFNΑ組STAT1、PKR和MXA的MRNA表達(dá)低于IFNΛ組（569±022VS581±033，431±020VS476±026，349±027VS380±020），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜005）。32各指標(biāo)蛋白表達(dá)水平的變化IFNΑ組USP18蛋白表達(dá)低于IFNΛ組（176±016VS190±012），差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜005。兩組細(xì)胞PSTAT1表達(dá)無差異（129±015VS130±019，P＞005）。IFNΑ組PKR、MXA蛋白表達(dá)低于IFNΛ組140±010VS149±014，123±011VS142±014，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜005）。結(jié)論1在HUH7細(xì)胞內(nèi)IFNΛ的抗病毒信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不受USP18的影響。2在對IFNΑ刺激不敏感的HUN7細(xì)胞中IFNΛ仍能激活抗病毒信號通路，促進(jìn)抗病毒蛋白的生成。3IFNΑ刺激HUH7細(xì)胞后抗病毒蛋白生成迅速，但消退速度也快而IFNΛ刺激后抗病毒蛋白的生成相對緩慢，但持續(xù)的時間更加的持久。4重復(fù)使用IFNΑ刺激HUH7細(xì)胞后USP18水平明顯升高，抗病毒蛋白生成減少。5重復(fù)使用IFNΛ刺激HUH7細(xì)胞USP18的升高不明顯，抗病毒蛋白生成未見減少。

簡介：該研究運(yùn)用分子生物學(xué)的技術(shù)方法，結(jié)合臨床與流行病學(xué)的資料，分析HBV基因的變異初步篩選了可能與宮內(nèi)感染有關(guān)的特異性基因結(jié)構(gòu)，探討了HBV基因異質(zhì)性與宮內(nèi)感染的可能關(guān)系，從而為阻斷HBV的宮內(nèi)傳播提供理論依據(jù)方法①1997年8月1995年5月和2001年8月2002年1月收集陜西省婦幼保健院婦產(chǎn)科足月分娩的HBSAG陽性孕婦及其新生兒外周血共70對根據(jù)新生兒發(fā)生宮內(nèi)感染與否將其母親分為宮內(nèi)感染組織和未感染組同時還收集到1例孕中期限引產(chǎn)的HBSAG陽性孕婦血清和引產(chǎn)胎兒肝臟②提取血清中HBVDNA擴(kuò)增宮內(nèi)感染組4對母嬰和未感染組5例母親HBV25KB或12KB基因片斷PCR產(chǎn)物純化后克隆入PUC19載體經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定共得到63株HBV序列③采用MEGALIGN軟件對全部HBV株前CC基因前SS基因序列進(jìn)行分析確定基因亞型和血清亞型構(gòu)建種系進(jìn)化樹比較各基因區(qū)的差異性④比較發(fā)生宮內(nèi)感染的4對母嬰HBV序列間基因位點(diǎn)的不同基因差異性的高低以及種系進(jìn)化關(guān)系⑤分別比較宮內(nèi)感染組新生兒和未感染組母親、宮內(nèi)感染組母親和未感染組母親之間核苷酸序列、氨基酸序列的羞異⑥護(hù)增引產(chǎn)孕婦HBV25KB基因片斷和引產(chǎn)胎肝中HBVS區(qū)500BP基因片斷克隆后各選取一株母胎序列進(jìn)行相似性分析產(chǎn)同其它序列的變異位點(diǎn)進(jìn)行比較結(jié)論①母體內(nèi)的優(yōu)勢株和弱勢株都可以通過宮內(nèi)傳播感染新生兒可能是單株感染也可能是混合感染母體的優(yōu)勢株和新生兒體內(nèi)的優(yōu)勢株不一定相同提示HBV的宮內(nèi)感染存在選擇性②發(fā)行宮內(nèi)感染的HBV株在NT3021、NT293、NT483、NT797和NT1827、NT2909、NT399、NT811、NT817位點(diǎn)突變很少或沒有提示不具有上述突變的HBV株可能具有選擇優(yōu)勢容易引起新生兒宮內(nèi)感染③HBV不同區(qū)域的變異對病毒本身結(jié)構(gòu)和功能的影響不盡相同從而對宮內(nèi)感染的發(fā)生與否可能產(chǎn)生不同的效應(yīng)

簡介：目的構(gòu)建人3型腺病毒載體嵌入登革熱病毒抗原表位的重組腺病毒，為人3型腺病毒衣殼嵌合載體的應(yīng)用及登革熱病毒疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。方法人3型腺病毒骨架質(zhì)粒PBRAD△E3GFP為模板，搭橋PCR擴(kuò)增六鄰體不同超變區(qū)（HVR）嵌入不同血清型登革病毒抗原表位的六鄰體突變基因片段HEXONDENV，突變的六鄰體片段酶切后克隆到穿梭載體。穿梭質(zhì)粒酶切后與線性化的PBRAD△E3GFP電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BJ5183進(jìn)行同源重組，鑒定后獲得陽性重組腺病毒質(zhì)粒PBRAD△E3GFPDENV。經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定登革病毒抗原表位正確插入相應(yīng)HVR后，中抽質(zhì)粒并酶切線性化后轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞包裝重組腺病毒。成功包裝的重組腺病毒經(jīng)大量擴(kuò)增培養(yǎng)及純化后，進(jìn)行熱穩(wěn)定性和生長曲線分析，WESTERNBLOT和ELISA實(shí)驗(yàn)分析嵌合的登革病毒抗原表位在六鄰體上表達(dá)及在重組腺病毒粒子表面的暴露情況。重組腺病毒免疫BALBC小鼠，通過WESTERNBLOT和ELISA實(shí)驗(yàn)檢測免疫小鼠對重組腺病毒的體液免疫反應(yīng)，微量中和實(shí)驗(yàn)檢測抗血清體外中和登革病毒的作用。結(jié)果通過搭橋PCR擴(kuò)增出HVR1嵌入登革病毒1型抗原表位、HVR2插入登革病毒3型抗原表位，HVR5嵌入登革病毒2型抗原表位的突變六鄰體片段。成功將突變的六鄰體片段克隆到穿梭載體后酶切線性化，與線性化的腺病毒骨架質(zhì)粒同源重組后，獲得四個重組腺病毒質(zhì)粒。在AD293細(xì)胞中成功包裝出在六鄰體HVR1嵌入登革病毒1型抗原表位和在HVR2嵌入登革病毒3型抗原表位的重組腺病毒AD3R1DENV1和AD3R2DENV3，在六鄰體HVR5區(qū)的嵌入登革病毒2型抗原表位的重組腺病毒質(zhì)粒未能成功包裝出重組病毒。重組腺病毒的熱穩(wěn)定性和生長特性不受插入登革病毒抗原表位影響。登革病毒1型和3型抗原表位在六鄰體蛋白融合表達(dá)并且暴露在病毒粒子表面。WESTERNBLOT，ELISA結(jié)果顯示重組腺病毒免疫小鼠即誘導(dǎo)登革病毒表位特異性抗體。體外中和實(shí)驗(yàn)中，重組腺病毒免疫的小鼠血清對登革病毒感染C636細(xì)胞中和作用微弱。結(jié)論成功構(gòu)建表達(dá)登革病毒抗原表位嵌合型人3型重組腺病毒重組腺病毒能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性的體液免疫應(yīng)答。

簡介：目的利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)MERSCOVS1和RBD蛋白，明確其作為重組疫苗靶抗原的免疫原性和誘導(dǎo)中和抗體的能力；利用制備的S1重組蛋白篩選制備具有中和活性的抗MERSCOV單克隆抗體。方法（1）構(gòu)建含有MERSCOVS1基因的重組桿狀病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞包裝桿狀病毒。重組病毒傳代3次獲得種子病毒，感染SF9細(xì)胞，收獲感染上清，通過鎳離子親和層析純化獲得S1重組蛋白。利用純化的S1蛋白免疫BALBC小鼠，通過ELISA檢測免疫小鼠血清抗原特異性的抗體水平；通過假病毒以及活病毒中和試驗(yàn)檢測血清中抗體的中和活性。同時利用重組表達(dá)S1蛋白免疫BALBC小鼠，將免疫后小鼠脾細(xì)胞與SP20骨髓瘤細(xì)胞融合，通過ELISA篩選出陽性克隆，隨后通過多次亞克隆篩選出穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，制備單抗腹水并進(jìn)行抗體效價測定及亞類鑒定；通過MERSCOV假病毒及活病毒中和試驗(yàn)篩選出中和單抗。（2）利用生物信息學(xué)方法對MERSCOVS1基因序列、二級結(jié)構(gòu)、柔性分析；同時對MERSCOVRBD、MERSCOV單克隆抗體及MERSCOVRBD與細(xì)胞受體DPP4結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測在S1內(nèi)部具有免疫保護(hù)功能區(qū)段355590AA；針對預(yù)測的免疫功能保護(hù)區(qū)設(shè)計添加FOLDON序列，構(gòu)建含有MERSCOVRBD、MERSCOVRBDFD基因的重組桿狀病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞包裝桿狀病毒。重組病毒傳代3次獲得種子病毒進(jìn)而感染SF9細(xì)胞，收獲感染上清，通過鎳離子親和層析純化獲得RBD、RBDFD重組蛋白。利用純化的重組蛋白免疫BALBC小鼠，通過ELISA檢測免疫小鼠血清抗原特異性的抗體水平；通過假病毒以及活病毒中和試驗(yàn)檢測血清中抗體的中和活性。結(jié)果（1）獲得了表達(dá)MERSCOVS1蛋白的重組病毒株，并在昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)和純化了分子量約140KDS1重組蛋白。利用重組表達(dá)的S1蛋白免疫小鼠三次，血清S1特異性IGG抗體滴度可達(dá)1102400；免疫小鼠血清稀釋5120倍后中和百分比仍能達(dá)到50％以上，且具有良好的活病毒中和活性。（2）利用重組的MERSCOVS1蛋白篩選獲得了10株能夠穩(wěn)定分泌抗原特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株。制備的腹水單抗亞類為6株為IGG1型，2株為IGG2A型，2株為IGM型；10株單抗抗體ELISA效價達(dá)到10000以上，并獲得1株單抗對MERSCOV具有良好的中和活性。（3）獲得了表達(dá)MERSCOVRBD、MERSCOVRBDFD蛋白的重組病毒株，在昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)并純化了分子量約40KDMERSCOVRBD單體重組蛋白以及分子量約100KDMERSCOVRBDFD寡聚體蛋白。利用重組表達(dá)的RBD單體蛋白免疫小鼠三次，血清MERSCOVRBD特異性IGG抗體滴度可達(dá)16400；免疫小鼠血清稀釋3200倍后中和百分比低于50，對MERSCOV假病毒的中和活性較弱。而利用形成寡聚體的RBD蛋白在一次加強(qiáng)免疫后，血清中MERSCOVRBDFD特異性IGG抗體滴度可達(dá)1102400；免疫小鼠血清稀釋12800倍后中和百分比仍高于50。結(jié)論利用昆蟲細(xì)胞重組表達(dá)的MERSCOVS1蛋白具有良好的免疫原性，并能夠有效誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度保護(hù)性中和抗體，篩選制備出一株具有良好中和活性的MERSCOV單克隆抗體。重組表達(dá)的MERSCOVRBD單體蛋白免疫原性以及對假病毒中和活性都較弱；利用昆蟲細(xì)胞重組表達(dá)的MERSCOVRBDFD寡聚體重組蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性，能夠有效誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度中和抗體，對MERSCOV假病毒以及活病毒都具有很好的中和活性。該研究為發(fā)展一種安全有效的針對MERSCOV的預(yù)防疫苗奠定了堅實(shí)基礎(chǔ)。

簡介：目的肝纖維化是多種原因所致慢性肝病發(fā)展為肝硬化及肝癌的中間階段，其發(fā)病原因及致病機(jī)制較為復(fù)雜。目前認(rèn)為肝纖維化是各種因子如肝炎病毒、血吸蟲病、酒精、藥物及毒物等長期持續(xù)損害肝臟，組織發(fā)生修復(fù)時細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡而引起的病理變化。肝星狀細(xì)胞是纖維化肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)的主要合成細(xì)胞，肝星狀細(xì)胞激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)。各種致肝纖維化因素均把肝星狀細(xì)胞作為最終靶細(xì)胞，通過促使其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞這一共同途徑導(dǎo)致肝纖維化的形成。乙型肝炎病毒在肝纖維化的進(jìn)展中是一種高風(fēng)險因素。盡管目前普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為纖維化的產(chǎn)生是由于肝臟炎癥所誘導(dǎo)的，但乙肝病毒是否直接促進(jìn)肝纖維化，至今尚不明確。本研究的目的是通過使用乙肝病毒表面抗原直接刺激目前認(rèn)為可以代替未成熟人類肝星狀細(xì)胞的LX2細(xì)胞系進(jìn)行研究，探討乙肝病毒表面抗原是否會促進(jìn)人肝星狀細(xì)胞LX2的增殖和提高Α平滑肌肌動蛋白及Ⅰ型膠原蛋白在人肝星狀細(xì)胞LX2中的表達(dá)水平，進(jìn)而引起肝纖維化。尋找乙肝病毒攜帶者等相對穩(wěn)定的乙肝病毒感染者形成肝硬化的可能機(jī)制。方法1在體外貼壁培養(yǎng)人肝星狀細(xì)胞LX2，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞活性及形態(tài)2將對數(shù)生長期LX2細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后加入不同終濃度的乙肝病毒表面抗原刺激24H，用噻唑藍(lán)法測乙肝病毒表面抗原對LX2細(xì)胞增殖的影響，并篩選出后續(xù)實(shí)驗(yàn)的刺激濃度3將對數(shù)生長期的LX2細(xì)胞均勻的接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，將一定濃度的乙肝病毒表面抗原加入人肝星狀細(xì)胞LX2中對其刺激，以單獨(dú)培養(yǎng)的人肝星狀細(xì)胞LX2為對照組，培養(yǎng)24H424H后分別收集細(xì)胞上清液，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測乙肝病毒表面抗原對LX2細(xì)胞的Α平滑肌肌動蛋白和膠原蛋白Ⅰ的蛋白表達(dá)水平的影響5用SPSS180軟件包，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對比實(shí)驗(yàn)組與對照組的Α平滑肌肌動蛋白和膠原蛋白Ⅰ的表達(dá)水平。結(jié)果1LX2細(xì)胞生長活性良好，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞呈星狀，胞核呈橢圓形。2噻唑藍(lán)法檢測結(jié)果顯示不同濃度的乙肝病毒表面抗原均明顯抑制LX2細(xì)胞的增殖。3酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測結(jié)果顯示與單獨(dú)培養(yǎng)的LX2細(xì)胞對照相比，加入乙肝病毒表面抗原刺激的LX2細(xì)胞組Α平滑肌肌動蛋白在人肝星狀細(xì)胞的表達(dá)水平無明顯變化P＞005，Ⅰ型膠原蛋白在人肝星狀細(xì)胞的表達(dá)水平無明顯變化P＞005。結(jié)論1一定濃度乙肝病毒表面抗原抑制人肝星狀細(xì)胞的增殖。2乙肝病毒表面抗原對Α平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原蛋白在人肝星狀細(xì)胞的表達(dá)水平無影響。3乙肝病毒表面抗原不能促進(jìn)人肝星狀細(xì)胞的活化。

簡介：安徽醫(yī)科大學(xué)安徽醫(yī)科大學(xué)ANHUIMEDICALUNIVERSITY碩士學(xué)位論文碩士學(xué)位論文晚期非小細(xì)胞肺癌化療病人生活質(zhì)量晚期非小細(xì)胞肺癌化療病人生活質(zhì)量及認(rèn)知功能改變分析及認(rèn)知功能改變分析THECHANGEOFQOLANDCOGNITIVEFUNCTIONOFPATIENTSWITHNSCLCUNDERGOINGCHEMOTHERAPYATTERMINALSTAGE作者姓名莫夢姣指導(dǎo)教師胡杰貴教授學(xué)科專業(yè)全科醫(yī)學(xué)研究方向原發(fā)性支氣管肺癌論文工作時間2013年6月至2015年3月2015年05月目錄目錄英文英文縮略詞表1摘要摘要2ABSTRACT3引言引言5對象與方法象與方法7結(jié)果12討論討論15結(jié)論結(jié)論19參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)21附錄24致謝25綜述26附表附表136附表附表238附表附表341

簡介：中山大學(xué)碩士學(xué)位論文人端粒酶催化亞單位HTERT基因重組腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定姓名廖亞平申請學(xué)位級別碩士專業(yè)人體解剖與組織胚胎學(xué)指導(dǎo)教師汪華僑20060501碩上論文人端粒酶催化亞單位HTERT基因重組腺病毒找體的構(gòu)建與鑒定且既可感染增殖細(xì)胞又可感染非增殖細(xì)胞。構(gòu)建HTERT基因重組腺病毒并鑒定其對原代培養(yǎng)神經(jīng)元的感染力以及基因轉(zhuǎn)移效果，可為后續(xù)的研究創(chuàng)造條件，為探索以端粒酶為靶點(diǎn)的AD基因治療新途徑奠定基礎(chǔ)。本研究包括以下兩個主要內(nèi)容第一章HTERT重組腺病毒骨架載體PADHTERT的構(gòu)建目的構(gòu)建HTERT重組腺病毒骨架載體PADHTERT方法以質(zhì)粒PCINEOHTERT為模板，毆計引物，兩端引入酶切位點(diǎn)，PCR法獲取目的基因；將目的基因定向克隆到PADTRACKCMV穿梭質(zhì)粒得到重組穿梭質(zhì)粒PADTRACKHTERT并酶切及測序鑒定；PME1線性化的重組穿梭質(zhì)粒和空穿梭質(zhì)粒分別與腺病毒骨’架PADEASY1在BJ5183菌進(jìn)行同源重組，得到HTERT重組腺病毒骨架質(zhì)粒PADHTERT和對照GFP腺病毒骨架質(zhì)粒PADGFP，酶刨鑒定。將鑒定正確的PADHTERT和PADGFP轉(zhuǎn)化DH5Q凍存?zhèn)溆?。結(jié)果酶切及測序分析重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建正確，目的基因未突變；酶切分析證實(shí)重組穿梭質(zhì)粒和空穿梭質(zhì)粒與PADEASY1正確同源重組，HTERT重組腺病毒骨架質(zhì)粒帶有目的基因。第二章HTERT重組腺病毒AD_HTERT的包裝、擴(kuò)增與鑒定目的包裝、鑒定HTERT重組腺病毒，并擴(kuò)增獲得高滴度腺病毒。方法PACI酶切線性化PADHTERT和PADGFP腺病毒骨架質(zhì)粒，純化滅菌；利用FUGENE6TRANSFECTIONREAGENT將兩種病毒骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞；熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)，收集病毒上清，PCR法鑒定目的基因；病毒上清重復(fù)感染HEK293獲得高滴度重組腺病毒；測定重組腺病毒感染復(fù)數(shù)MULTIPLICITYOFINFECTION，MOI；感染人胚胎海馬原代培養(yǎng)神經(jīng)元RTPCR法分析目的基因的表達(dá)。結(jié)果PCR結(jié)果說明重組腺病毒攜帶目的基因報告基因GFP的表達(dá)顯示重

簡介：暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文題目（中英文對照）題目（中英文對照）前列腺素前列腺素E1改善改善血管性癡呆血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能及相關(guān)血管新生機(jī)制研究大鼠認(rèn)知功能及相關(guān)血管新生機(jī)制研究PGE1MODIFIESCOGNITIVEIMPAIRMENTINVULARDEMENTIARATSTHROUGHANGIOGENESIS作者姓名劉博會指導(dǎo)教師姓名及學(xué)位、職稱張素平學(xué)士學(xué)位、主任醫(yī)師學(xué)科、專業(yè)名稱臨床醫(yī)學(xué)碩士（神經(jīng)病學(xué)）論文提交日期2015年04月18日論文答辯日期2015年06月04日答辯委員會主席解龍昌主任醫(yī)師論文評閱人盲審（四川大學(xué)華西醫(yī)院；南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院）學(xué)位授予單位和日期暨南大學(xué)2015年06月暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文前列腺素E1改善VD大鼠認(rèn)知功能及相關(guān)血管新生機(jī)制研究I摘要摘要研究背景研究背景血管性癡呆（VULARDEMENTIAVD）是一種以認(rèn)知功能障礙為主要癥狀的臨床綜合征，發(fā)病率正在逐年提高，給社會及家庭造成了沉重的負(fù)擔(dān)。VD多繼發(fā)于腦血管疾病或伴有腦血管病高危因素，且近來研究認(rèn)為血管損傷和內(nèi)皮功能異常參與到VD的發(fā)生發(fā)展，尤其是丘腦、海馬及皮層缺血性改變，提示腦缺血與VD發(fā)生密切相關(guān)。海馬在學(xué)習(xí)功能中扮演著重要角色，對缺血缺氧性損傷較敏感，長期慢性腦低灌注可繼發(fā)海馬缺血缺氧性損害，進(jìn)而影響其學(xué)習(xí)記憶功能，與VD發(fā)生關(guān)系密切。而腦缺血后內(nèi)源性或外源性促血管生長因子如血管內(nèi)皮生長因子（VULARENDOTHELIALGROWTHFACTVEGF）的增加，可促進(jìn)缺血區(qū)及缺血周圍區(qū)血管再生、改善側(cè)支循環(huán)、增加腦灌注，從而促進(jìn)腦功能恢復(fù)，且癡呆患者腦脊液中VEGF亦有升高。因此我們提出或許外源性促血管再生因子可通過促進(jìn)海馬組織血管再生而增加海馬組織灌注進(jìn)而改善認(rèn)知功能。研究認(rèn)為前列腺素E1（PGE1）可通過上調(diào)VEGF的表達(dá)而促進(jìn)心臟血管再生，但PGE1對VD海馬組織的影響尚不清楚。目的目的探討PGE1對VD大鼠行為認(rèn)知功能的影響及相關(guān)血管再生機(jī)制。方法方法SD（SPRAGUEDAWLEY，SD）大鼠隨機(jī)分到假手術(shù)組、PGE1組、溶劑對照組、PGE1VEGFR拮抗劑組，每組12只，其中PGE1組、溶劑對照組、PGE1VEGFR拮抗劑組采用雙側(cè)頸動脈永久性結(jié)扎法（BILATERALCOMMONCAROTIDARTERYOCCLUSION，BCCAO）制作VD模型，所有大鼠術(shù)后進(jìn)行5天的定位航行實(shí)驗(yàn)以篩選出造模成功大鼠，之后PGE1組予前列腺素E1注射液連續(xù)7天尾靜脈注射（10MGKGD），溶劑對照組給予等量的生理鹽水注射液注射，PGE1VEGFR拮抗劑組在給予等劑量前列腺素E1注射液治療的同時給予SU5416（VEGFR2特異性拮抗劑）腹腔注射（25MGKGD）。采用水迷宮實(shí)驗(yàn)對大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能進(jìn)行評價；免疫組化染色分別觀察海馬組織血管新生情況；WB、RTQPCR分別半定量測定海馬組織VEGF蛋白、VEGFMRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果結(jié)果定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果各組平均潛伏期隨著時間的延長而呈遞減趨勢P001，PGE1組逃避潛伏期小于溶劑對照組及PGE1VEGFR拮抗劑組P005，而溶劑對照組高于假手術(shù)組P005；空間探索中，假手術(shù)組、PGE1組大鼠在原平臺位置附近來回穿梭游泳，軌跡呈“穿梭型”，而溶劑對照組及PGE1VEGFR拮抗劑組則沿著水池邊緣盲目隨機(jī)地游泳，軌跡呈“邊緣型”，各組跨越平臺次數(shù)如下假手術(shù)組654108，PGE1組577083，溶劑對照組288047，PGE1VEGFR拮抗劑組263044，其中溶劑對照組及VEGFR

簡介：復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文微型腺病毒載體介導(dǎo)狗FIXCDNA的表達(dá)及安全性檢測系統(tǒng)的建立姓名王飛申請學(xué)位級別碩士專業(yè)遺傳學(xué)指導(dǎo)教師盧大儒200061墜竺堅莖望墮生二二二塑墨_三摘要腺病毒載休因其轉(zhuǎn)染效率高，制各方便，可直接注射等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于單基因遺傳病、惡性腫瘤等的基因治療。但由于腺病毒載體本身可誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)，不能長期穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)，而且其包裝容量有限。所以近年來人們一直致力于降低腺病毒載體免疫原性，增加其包裝容量的研究。一本論文在第一代腺病毒載體介導(dǎo)人FIX表達(dá)的基礎(chǔ)上．開展了微型腺病毒基因治療血友病的初步研究。用缺失所有腺病毒結(jié)構(gòu)基因、同時攜帶狗FⅨ基因和綠色熒光蛋白6FP基因的微型腺病毒載體MAD，進(jìn)行離體、活體表達(dá)的嘗試，以期達(dá)到延長外源基因的表達(dá)時F．1，降低腺病毒免疫原性的目的。F通過在293包裝細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增微型腺病毒載體MAD及輔助性腺病毒ADH／3，并氯化銫梯度超離心純化后，得到了以MAD為主及以ADH／}為主的兩種腺病毒純化液。將兩種腺病毒液進(jìn)行離體及活體轉(zhuǎn)雜后，檢測得FⅨ表達(dá)量在離體培養(yǎng)細(xì)胞上清中達(dá)57UG／M1／106CELLS／24HR，活性達(dá)78鬈FIX剔除小鼠血漿中為6母_RLG／ML，活性達(dá)67％，持續(xù)表達(dá)F4周以上。，”通過PCR方法及常規(guī)石蠟包埋切片方法．未檢測出宿王細(xì)胞內(nèi)有復(fù)制活性的腺病毒，小鼠各臟器未見明顯毒性反應(yīng)。以上結(jié)果顯示MAD介導(dǎo)的DFⅨ基因在離體及活體內(nèi)均有高效表達(dá)，初步安全性檢測無明顯毒性，但由于MAD在純化日寸，與ADHB不能完全分開，導(dǎo)致MAD中有約1％的ADH口的污染，最終導(dǎo)致FIX在表達(dá)14周后被清除。因此．在將來的基因治療的應(yīng)用中，MAD本身的穩(wěn)定性及應(yīng)用系統(tǒng)還需做一定的改進(jìn)，以適應(yīng)高效、安全、穩(wěn)定的表達(dá)栽體的要求。J關(guān)鍵詞微型腺病毒載體輔助病毒基因治療免疫反應(yīng)血友病學(xué)科分類號071007

簡介：點(diǎn)擊查看更多腸道病毒71型3C蛋白酶拮抗TAK1復(fù)合體介導(dǎo)的天然免疫信號通路的機(jī)制研究.pdf精彩內(nèi)容。