人源iPSC中致聾基因MYO15A的修正對(duì)誘導(dǎo)獲得的毛細(xì)胞樣細(xì)胞的形態(tài)和功能的影響.pdf

1、耳聾和聽力障礙是全球性重大健康問題之一。耳是人類重要的聽覺以及平衡器官，內(nèi)耳毛細(xì)胞是聽覺轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵感覺細(xì)胞。當(dāng)聲波經(jīng)過的時(shí)候，毛細(xì)胞通過其表面靜纖毛的擺動(dòng)，將聲波信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并由神經(jīng)傳給大腦，從而產(chǎn)生聽覺。內(nèi)耳毛細(xì)胞的損傷或丟失是誘發(fā)耳聾和聽力喪失的主要原因之一。噪音、衰老、基因突變或藥物濫用（尤其是氨基糖苷類抗生素）都可能會(huì)導(dǎo)致內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷或喪失。在哺乳動(dòng)物中，包括人類，內(nèi)耳毛細(xì)胞一旦遭到破壞，將無法再生，這將導(dǎo)致永久性耳聾。

2、研究耳聾的發(fā)病機(jī)理，探索如何在哺乳動(dòng)物（以至于人類）中再生正常內(nèi)耳毛細(xì)胞，這將為治療耳聾或聽力喪失提供幫助。
　　誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)是一類性狀極其類似于胚胎干細(xì)胞(ESC)的多能干細(xì)胞。規(guī)避倫理問題，分化能力的全能性，無限的擴(kuò)增能力，獲得病人特異iPSC的能力以及自體移植不存在免疫排斥的效應(yīng)，這些種種優(yōu)勢都使iPSC在再生醫(yī)學(xué)，疾病模型以及藥物篩選等領(lǐng)域擁有廣闊的應(yīng)用前景。基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)，尤其是CRISPR/Cas9技

3、術(shù)的快速發(fā)展，使人類能夠隨心所欲的改造或是修正基因。近幾年來內(nèi)耳毛細(xì)胞再生研究的突破性進(jìn)展，使哺乳動(dòng)物毛細(xì)胞再生方法日趨成熟。本研究中，通過iPSC技術(shù)，我們建立了致聾基因MYO15A突變的iPSC細(xì)胞系;通過CRISPR/Cas9技術(shù)，我們將MYO15A突變iPSC細(xì)胞系中的MYO15A基因進(jìn)行了修正;通過將iPSC體外誘導(dǎo)分化毛細(xì)胞，我們證明了MYO15A的基因校正逆轉(zhuǎn)了由MYO15A突變導(dǎo)致的毛細(xì)胞樣細(xì)胞的形態(tài)和功能缺陷。

4、　　第一部分:通過逆轉(zhuǎn)錄病毒，我們將來源于MYO15A突變耳聾病人(MYO15Ac.4642G＞A，c.8374G＞A)，病人父親(MYO15A c.8374G＞A)以及一個(gè)聽力正常女孩的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成了iPSC（分別為M-/-iPSC、M+/-iPSC和M+/+iPSC）。三株iPSC都表現(xiàn)出與ESC類似的特性，例如AP陽性，表達(dá)多能干細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白OCT4，SOX2，NANOG，SSEA4，TRA-1-60以及TRA-1-81

5、，具有體內(nèi)外三胚層分化的潛能。同時(shí)對(duì)這三株iPSC的核型進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，在經(jīng)過重編程的漫長過程后，三株細(xì)胞系都保持了正常的核型。
　　第二部分:通過單層貼壁誘導(dǎo)法，我們將三株iPSC誘導(dǎo)成了聽祖細(xì)胞，誘導(dǎo)獲得的聽祖細(xì)胞表達(dá)聽相關(guān)特異性標(biāo)志蛋白與基因。通過分離聽上皮祖細(xì)胞，并與雞胚橢圓囊基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，我們成功獲得了三株細(xì)胞的毛細(xì)胞樣細(xì)胞。誘導(dǎo)獲得的毛細(xì)胞樣細(xì)胞表達(dá)毛細(xì)胞特異標(biāo)志基因與蛋白，能夠特異攝取FM1-43染料，具有與

6、內(nèi)耳毛細(xì)胞類似的鉀電流和鈣電流，并且在這些細(xì)胞的表面存在毛細(xì)胞特異的靜纖毛樣結(jié)構(gòu)。但同時(shí)也觀察到了MYO15A突變對(duì)M-/-iPSC誘導(dǎo)獲得的毛細(xì)胞樣細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響。M-/-iPSC誘導(dǎo)獲得的毛細(xì)胞樣細(xì)胞與M+/+iPSC和M+/-iPSC誘導(dǎo)獲得的毛細(xì)胞樣細(xì)胞相比表現(xiàn)出肌動(dòng)蛋白絲結(jié)構(gòu)的紊亂以及顯著縮短的靜纖毛樣結(jié)構(gòu)。
　　第三部分:利用CRISPR-Cas9介導(dǎo)的同源重組技術(shù)，我們對(duì)M-/-iPSC中MYO15A c.46

7、42G＞A突變位點(diǎn)進(jìn)行了校正。我們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)建了打靶載體pX330-maxGFP-sgRNA4，同源重組模板ssODN以及pUC19-MYO15Asyonymous用于基因校正實(shí)驗(yàn)。通過流式細(xì)胞分選以及Sanger測序，我們成功篩選獲得了基因校正的MC/-iPSC細(xì)胞系。MC/-iPSC維持正常細(xì)胞核型，表達(dá)多能干細(xì)胞標(biāo)志基因與蛋白，且具有體內(nèi)外分化的全能性。
　　第四部分:為了了解MYO15A c.4642G＞A位點(diǎn)的基因校正對(duì)M

8、-/-iPSC誘導(dǎo)獲得的毛細(xì)胞樣細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能的影響，我們將基因校正的MC/-iPSCs誘導(dǎo)聽祖細(xì)胞，并進(jìn)一步誘導(dǎo)為內(nèi)耳毛細(xì)胞樣細(xì)胞。與M+/+iPSC和M+/-iPSC相似，MC/-iPSC分化的聽祖細(xì)胞，表達(dá)聽相關(guān)基因與蛋白，分化的毛細(xì)胞樣細(xì)胞，表達(dá)毛細(xì)胞特異性標(biāo)記基因與蛋白。MC/-iPSC誘導(dǎo)獲得的毛細(xì)胞樣細(xì)胞具有與M+/+iPSC和M+/-iPSC誘導(dǎo)獲得的毛細(xì)胞樣細(xì)胞相似的電壓依賴電流，具有正常的肌動(dòng)蛋白絲組織，正常的靜纖

9、毛長度，這與M-/-iPSC誘導(dǎo)獲得的毛細(xì)胞樣細(xì)胞的表現(xiàn)（肌動(dòng)蛋白絲結(jié)構(gòu)的紊亂以及顯著縮短的靜纖毛樣結(jié)構(gòu)）具有顯著差異。我們的研究表明MYO15A的基因校正逆轉(zhuǎn)了由MYO15A突變導(dǎo)致的毛細(xì)胞樣細(xì)胞的形態(tài)和功能缺陷。
　　總之，本研究通過對(duì)致聾基因MYO15A突變的iPSC細(xì)胞系的基因校正與內(nèi)耳毛細(xì)胞的誘導(dǎo)分化成功證明了從人iPSC誘導(dǎo)獲得毛細(xì)胞樣細(xì)胞的可行性，同時(shí)也證明了基因校正能有效逆轉(zhuǎn)MYO15A突變導(dǎo)致的毛細(xì)胞樣細(xì)胞的形態(tài)