1.慢性粒細(xì)胞性白血病融合基因bcrabl第一外顯子條件性基因打靶的實(shí)驗(yàn)研究;2.rna干擾在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的初步應(yīng)用性研究

1、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文1.慢性粒細(xì)胞性白血病融合基因bcr/abl第一外顯子條件性基因打靶的實(shí)驗(yàn)研究;2.RNA干擾在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的初步應(yīng)用性研究姓名：楊帆申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：病原生物學(xué)指導(dǎo)教師：王樹(shù)蕙;劉力20040901中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文一外顯子序列，并將四個(gè)D N A 片段依次分步克隆到載體p f l o x 中，構(gòu)建了打靶載體p F A B U D 。將該載體轉(zhuǎn)化可表達(dá)C r e 酶的菌株D H 5 n ／

2、C r e ，并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果顯示重新轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒比p F A B U D 小5 K b 左右，提示p F A B U D 上的l o x P 位點(diǎn)可在C r e 酶作用下發(fā)生定點(diǎn)重組，說(shuō)明我們已成功地構(gòu)建了打靶質(zhì)?！，F(xiàn)已將p F A B U D轉(zhuǎn)入K 5 6 2 細(xì)胞，發(fā)生同源重組的細(xì)胞系正在篩選之中。上述幾方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為下一步針對(duì)b E l 的可調(diào)控型基因打靶奠定了基礎(chǔ)。從體細(xì)胞水平對(duì)基因的第?外顯子進(jìn)行基因打靶目前在國(guó)

3、內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道，如果打靶成功，將會(huì)進(jìn)一步深入闡明C M L 的發(fā)生機(jī)制和病理生理演變過(guò)程，也將為條件性基因打靶在體細(xì)胞的應(yīng)用提供可靠的依據(jù)。R N A 干擾( R N A i ) 是一種由雙鏈R N A ( d s R N A ) 誘發(fā)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默，由啟動(dòng)和效應(yīng)兩個(gè)基本步驟組成：在啟動(dòng)階段，較長(zhǎng)的d s R N A 經(jīng)過(guò)D i c e r 切割，降解成2 1 ～2 3 個(gè)堿基的小干擾R N A ( s i R N A )

4、；在效應(yīng)階段，s i R N A 與R N A 酶結(jié)合形成R N A 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體，后者與靶m R N A 結(jié)合，導(dǎo)致靶m R N A 被切割，使目的基因的表達(dá)被抑制。由于R N A i 技術(shù)具有高效、專一、用量少、毒性小的特點(diǎn)，因此近年來(lái)已被廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)研究的諸多領(lǐng)域，如進(jìn)行新基因的功能研究，進(jìn)行抗病毒治療以及抗腫瘤治療等。本文利用R N A i 技術(shù)研究了R N A i 在抗S A R S 冠狀病毒( S A R S C o

5、 V ) 中的作用，并對(duì)細(xì)胞因子受體類因子3 ( c r l f 3 ) 這～新基因的功能進(jìn)行了初步研究。嚴(yán)重急性呼吸道綜合征( s A R S ) 是于2 0 0 2 年1 1 月中旬在我國(guó)華南地區(qū)首先出現(xiàn)的一種新型的嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)綜合征。S A R S 的病原體是一種新型的冠狀病毒，屬于單股正鏈R N A 病毒，基因組約2 9 7 0 0 n t ，在復(fù)制時(shí)不經(jīng)過(guò)D N A 階段，編碼的主要蛋白質(zhì)有R N A 聚合酶( R d R p

6、 ) 、棘突蛋白( S 蛋白) 、膜蛋白( E 蛋白) 、核衣殼蛋白( N蛋白) 等。本研究中，我們利用s i R N A s 對(duì)S A R S C o V 進(jìn)行干擾，觀察R N A i 對(duì)S A R SC o V 轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的影響，為深入闡明S A R SC o V 的致病機(jī)理提供理論基礎(chǔ)，并為探索R N A i 臨床應(yīng)用的可能性提供依據(jù)。實(shí)驗(yàn)中，首先針對(duì)不同蛋白設(shè)計(jì)合成了1 0 種不同的s i R N A s ，其中s i R N

7、A l ～2 靶向S A R S C o V 的前導(dǎo)序列，s i R N A 3 ～6 靶向R d R p序列，s i R N A 7 ～1 0 靶向s 蛋白序列；以不同劑量的S A R S C o V 感染V e r o E 6 細(xì)胞后，再以1 0 種s i R N A s 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。4 8 h 后提取細(xì)胞R N A ，通過(guò)實(shí)時(shí)定量P C R 法測(cè)定病毒R N A 水平，同時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。結(jié)果顯示在病毒感染劑量較