RNA聚合酶I介導轉錄的TBSV病毒表達載體研究.pdf

1、植物RNA病毒載體表達系統(tǒng)是近年發(fā)展起來的一類以植物作為反應器的新型表達系統(tǒng)。現(xiàn)有的植物RNA病毒表達載體多采用RNA聚合酶Ⅱ識別的啟動子（Ⅱ類啟動子）。番茄叢矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）在生物安全性、外源基因承載能力和表達高效性上都具有其他植物RNA病毒無法比擬的潛在優(yōu)勢。該病毒本身無帽子結構、多聚A尾和內含子，將病毒載體置于RNA PolⅠ識別啟動子（Ⅰ類啟動子）下游，轉錄產物更“像”野生型的

2、病毒，從而能有效地提高病毒侵染性。另外，RNA聚合酶Ⅰ識別的啟動子還具有種屬特異性，也有利于提高病毒載體表達系統(tǒng)的生物安全性。
　　 本研究對RNA PolⅠ介導轉錄的TBSV病毒表達載體進行了初步探索:克隆獲得含植物RNA聚合酶Ⅰ啟動子核心序列的514 bp本氏煙Ⅰ型啟動子DNA序列，通過多重序列比對，預測其轉錄起始位點位于保守核心序列中的第三個A處。構建了本氏煙Ⅰ型啟動子介導轉錄的TBSV病毒表達載體QW，通過農桿菌滲濾技術

3、將其接種寄主植物本氏煙。5'-RACE技術分別測定了本氏煙Ⅰ型啟動子和CaMV35S啟動子（Ⅱ型啟動子）介導轉錄的TBSV病毒5'末端第一位堿基，結果表明，經兩類啟動子轉錄均可在體內獲得完整5'末端的病毒基因組RNA且進一步驗證了生物信息學預測結果。整株、細胞和分子水平（蛋白質和RNA）三個層次的研究表明，本氏煙Ⅰ型啟動子介導TBSV病毒載體的表達效率高于Ⅱ型啟動子（CaMV35S啟動子）介導的TBSV病毒載體。共接種RNA沉默抑制子（

4、RNA Silencing Supressors，RSSs）2b的研究結果表明，共接種RSSs以提高植物RNA病毒載體表達系統(tǒng)表達效率的策略，不僅適用于Ⅱ型啟動子介導的病毒載體表達系統(tǒng)，同時也適用于Ⅰ型啟動子介導的病毒載體表達系統(tǒng)。推測，Ⅰ啟動子介導轉錄病毒表達載體表達效率的提高與回避病毒誘導基因沉默(Virus-Induced Gene Silencing，ViGS)途徑無關。Ⅰ型啟動子對病毒載體完整性的保持和轉錄的高效性可能是載體表