內含子介導的TBSV病毒表達載體的研究.pdf

1、植物RNA病毒載體表達系統(tǒng)是一種以植物為生物反應器的新型表達平臺。番茄叢矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）在生物安全性和外源基因承載量等方面具有潛在的優(yōu)勢，是一個構建新型植物RNA病毒表達載體的理想材料。實驗室前期構建了一系列TBSV病毒表達載體并能夠在寄主本氏煙上表達報道基因。在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，構建的TBSV病毒表達系統(tǒng)的表達穩(wěn)定性較差，極大地限制了該表達平臺的應用。
　　針對上述問題，本研究在

2、前期構建的TBSV病毒表達載體的基礎上，優(yōu)化載體設計并利用亞克隆技術構建了相關TBSV病毒表達載體。以農(nóng)桿菌滲濾接種法接種于植物煙草本氏煙，開展了如下相關研究。
　?、偻ㄟ^亞克隆技術對pTBSV-WY1載體的外源基因插入位點進行了修改，構建了病毒表達載體pTBSV-WY2。整株、細胞以及分子水平等三個層次的比較研究表明，pTBSV-WY2表達載體的表達效率和穩(wěn)定性都明顯優(yōu)于pTBSV-WY1。證明外源基因插入位點的選擇十分重要，合

3、適的外源基因插入位點能夠提高外源基因的表達水平和載體的表達穩(wěn)定性。
　　②選取擬南芥ACT2啟動子(AB026654，57962-58748 bp)，通過啟動子更換，在pTBSV-WY2的基礎上獲得病毒表達載體pTBSV-WY3。比較研究表明，來源不同的兩個Ⅱ型啟動子（35S啟動子和ACT2啟動子）驅動的病毒載體在外源基因的最大表達量上無顯著差異;二者在外源基因表達的時間變化規(guī)律上存在差異，推測時間變化規(guī)律上差別與啟動子本身的性質

4、有關。
　?、蹖υ诓《净蚪M編碼區(qū)內引入內含子以提高病毒載體表達效率的可行性和規(guī)律性進行了探索。通過亞克隆技術，在TBSV病毒基因組不同位置分別引入2個、9個和11個內含子，構建了TBSV病毒表達載體pTBSV-WY3-2intr，pTBSV-WY3-9intr和pTBSV-WY3-11intr。Northern blot結果表明，引入病毒基因組內的內含子在植物體內能夠被識別并剪切。GFP定性和定量分析結果表明，在病毒基因組內插入