新型微管抑制劑6a對耐藥腫瘤細胞KB-V的生長抑制作用研究.pdf

1、研究背景與目的
　　多藥耐藥(MDR)是指耐藥腫瘤對結(jié)構(gòu)與功能部分或完全不相關(guān)的抗腫瘤藥物表現(xiàn)顯著抗藥性。研究表明，多藥耐藥現(xiàn)象是導(dǎo)致惡性腫瘤化療失敗的關(guān)鍵原因?；熕幬锏呐R床廣泛應(yīng)用過程中出現(xiàn)的多藥耐藥現(xiàn)象，嚴重限制藥物的治療效果與應(yīng)用周期?？谇话┦且环N嚴重的、死亡率高的惡性腫瘤疾病。長春新堿(vincristine)是治療口腔癌的基礎(chǔ)化療藥物之一，多藥耐藥現(xiàn)象是降低長春新堿對口腔癌臨床療效的主要因素。與靶向紫杉醇類結(jié)合位點（如

2、紫杉醇）或長春堿類結(jié)合位點（如長春新堿）藥物相比，靶向秋水仙堿結(jié)合位點的化合物可能具有克服P-gp調(diào)控的腫瘤多藥耐藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)優(yōu)勢。6a是一種能與秋水仙堿結(jié)合位點展現(xiàn)高親和力的新型化合物。在本論文中，我們篩選了6a對多種敏感株及其耐藥株腫瘤細胞的抗腫瘤活性，在此基礎(chǔ)上探討了6a對長春新堿耐受的人口腔癌表皮樣細胞KB/V的生長抑制作用及分子機制。
　　實驗方法
　　1.6a對耐藥腫瘤細胞株的體外活性檢測。采用MTT法檢測多種耐

3、藥細胞(BEL7402/5-FU，MCF-7，KB/V)的耐藥性，在確定細胞具有穩(wěn)定耐藥性的基礎(chǔ)上，采用MTT法、克隆形成方法檢測了6a與秋水仙堿對多種耐藥細胞的生長抑制作用。2.6a對耐長春新堿的人口腔癌細胞(KB/V)的體內(nèi)生長抑制作用。選用裸鼠移植瘤模型檢測6a對KB/V細胞移植瘤的生長抑制作用。3.6a的作用靶點檢測。選擇羅丹明123(Rh123)胞內(nèi)蓄積實驗和western blotting法檢測6a對1 P-gp蛋白的外排功

4、能和表達量的影響;采用a-tubulin免疫熒光染色法檢測6a和秋水仙堿對微管蛋白聚合的抑制作用。4.探討6a對KB/V細胞生長抑制作用的分子機制。采用流式實驗檢測細胞周期分布（PI染色法），細胞凋亡(AnnexinV-FITC/PI染色法)和線粒體膜電位（JC-1染色法）;采用Hoechst33342核酸染色法觀察細胞的形態(tài)學(xué)改變;采用western blotting法考察6a對PTEN介導(dǎo)的信號通路的影響。
　　實驗結(jié)果

5、>　　1.體外抗增殖實驗結(jié)果表明6a具有比秋水仙堿更優(yōu)越的抗KB/V細胞增殖活性。更重要的是其對耐藥細胞株BEL7402/5-FU和MCF-7/A的生長抑制作用微弱，顯示出6a對KB/V細胞具有明顯的抗腫瘤選擇性。2.體內(nèi)移植瘤實驗結(jié)果顯示腹腔注射給藥劑量30 mg/kg的6a能顯著抑制KB/V細胞移植瘤的生長（抑瘤率為75.8％）且無明顯的毒性反應(yīng)。3.6a能明顯抑制KB/V細胞微管蛋白聚合、誘導(dǎo)G2/M期阻滯、細胞凋亡（線粒體依賴的

6、凋亡途徑）及下調(diào)PTEN/AKT/NF-κB信號通路。反之，6a對P-gp蛋白的外排功能及表達均無明顯影響。4.6a對KB/V細胞的抗增殖作用可能的分子機制:靶向秋水仙堿結(jié)合位點抑制微管蛋白的聚合;通過上調(diào)cyclin B1的表達及下調(diào)cdc-2，p-cdc2，cdc25B的表達促使細胞阻滯于G2/M期;誘導(dǎo)線粒體膜電位降低，下調(diào)Bcl-2/Bax的比率，促進細胞色素C的釋放和caspase9，PARP的活化激活線粒體依賴的細胞凋亡通路

7、;通過促進PTEN的去磷酸化，下調(diào)p-Akt，NF-κB的表達抑制PTEN/AKT/NF-κB信號通路的激活。
　　實驗結(jié)論
　　體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)，6a對耐藥腫瘤細胞KB/V具有很強的生長抑制作用和促進線粒體途徑依賴的細胞凋亡作用。作用機制與誘導(dǎo)G2/M期阻滯，抑制KB/V細胞內(nèi)微管蛋白聚合及調(diào)控PTEN/AKT/NF-κB信號通路有關(guān)。
　　研究意義
　　6a有望成為一種應(yīng)用于長春新堿耐藥的人口腔上皮癌的臨床化療