葛根素對泡沫細胞膽固醇攝取及外排功能的影響.pdf

1、【研究背景】冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CAD)是目前危害人類的主要心臟疾病之一。在冠心病的發(fā)生發(fā)展過程中，動脈粥樣硬化(AS)是其主要的病理生理學基礎，并且AS斑塊的不穩(wěn)定也是心血管事件發(fā)生的基礎。但對AS的研究目前仍有許多未知，對AS的發(fā)病機理仍未完全明確。
　　在AS斑塊的形成過程中，目前認為脂質沉積、氧化修飾和炎癥反應是其基本的病理特征，并且血脂代謝異常是AS病程中最重要的危險因素之一。經過氧化修飾后的低密度脂蛋白(OxLD

2、L)作為心血管疾病的獨立危險因素，對血管的內皮細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞均產生明顯的影響，其在病程中可損傷內皮功能、促進膽固醇的內皮下沉積和激活巨噬細胞遷移與吞噬，進而加速AS的演變。泡沫細胞貫穿著AS病變過程的始終，尤其是對斑塊的穩(wěn)定性有著重要影響。巨噬細胞吞噬了oxLDL后，將導致巨噬細胞內的脂質蓄積而形成巨噬細胞源性泡沫細胞。泡沫細胞對胞內脂質的代謝紊亂又將導致胞體的漲大、破裂并最終導致AS斑塊的破裂、出血而引發(fā)一系列心血管急癥的

3、發(fā)生。因此，深入研究泡沫細胞對膽固醇代謝的機制將有助于心血管系統(tǒng)疾病的防治。
　　細胞自噬(Autophagy)在心血管疾病的研究中為近年來的熱點，細胞自噬作為機體的一類細胞消化異體或過多的自體蛋白及細胞器的正常的生理過程，在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中同樣起著舉足輕重的作用，大量證據表明，在AS斑塊中血管內皮細胞、平滑肌細胞以及巨噬細胞等血管組織主要的細胞類型均有著自噬現象的改變，而其中，巨噬細胞占有重要的地位，因此進一步探討AS病

4、變過程中的巨噬細胞的自噬及其機制，將為臨床藥物研究以及臨床治療提供新的思路。
　　葛根素（Pur）作為國藥精華，已發(fā)現其具有擴張冠狀動脈、保護缺血心肌和抗心肌缺血再損傷、減少急性心肌梗死面積等多種作用，臨床上主要用于穩(wěn)定型心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛、心肌梗死等心血管疾病。目前關于Pur的研究也表明，其對AS有著保護作用。研究表明，Pur處理后動物模型中AS斑塊的形成明顯減少，血脂水平較模型組也明顯下降。而在肝細胞以及心肌細胞中， Pu

5、r處理可通過自噬水平的改變而調控細胞功能。但目前在泡沫細胞中，Pur對巨噬細胞自噬以及膽固醇代謝的相關研究仍有待進一步探討。
　　因此，本研究著眼于Pur對泡沫細胞自噬現象、胞內膽固醇蓄積以及泡沫細胞膽固醇外排能力的影響及其機制的探討。
　　【研究目的】在鼠源性巨噬細胞RAW264.7細胞中以熒光探針Dil-ox-LDL檢測細胞膽固醇攝取能力、熒光膽固醇外排實驗、蛋白免疫印跡實驗（WB）等方法，觀察Pur對oxLDL剌激下巨

6、噬細胞膽固醇攝取和膽固醇外排功能的影響及其可能的作用機制，進一步完善Pur的藥理機制并為臨床上葛根素的使用提供依據。
　　【研究方法】
　　1. RAW264.7細胞經oxLDL誘導形成巨噬細胞泡沫化模型。
　　2.不同濃度Pur處理oxLDL誘導的RAW264.7源性泡沫細胞。MTS法檢測不同濃度Pur處理后的細胞活力。
　　3.以oxLDL誘導RAW264.7源性泡沫細胞。細胞經處理后，利用dil-ox-LD

7、L檢測泡沫細胞膽固醇攝取、NBD標記膽固醇外排實驗檢測泡沫細胞的膽固醇外排功能以及western blot檢測LC3II, p62, CD36, ATP結合盒轉運蛋白A1(ABCA1)、溶酶體酸性脂肪酶（LAL）以及p-AMPK的表達。
　　【結果】
　　1. RAW264.7巨噬細胞經oxLDL孵育后，油紅O染色證實細胞中大量脂質小滴形成，表明已經轉變?yōu)榕菽毎?。體外細胞模型建立成功。
　　2.以不同劑量的Pur處理