CRT、gC1qR及其復合體在氧化應(yīng)激誘導細胞損傷中的作用機制.pdf

1、背景：
　　黑素細胞破壞或凋亡導致白癜風發(fā)病的機制是皮膚科研究熱點之一。越來越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激直接導致黑素細胞損傷或凋亡并啟動異常免疫應(yīng)答，是尋常型白癜風發(fā)病的重要機制。
　　鈣網(wǎng)織蛋白（CRT）又稱cC1qR，是補體C1q的主要受體之一，而C1q的另一受體gC1qR表達于除紅細胞外的幾乎所有哺乳動物細胞，在炎癥反應(yīng)、病毒感染、腫瘤轉(zhuǎn)移、調(diào)控細胞凋亡中有重要作用。gC1qR進入細胞線粒體內(nèi)蓄積，能導致線粒體功能障礙，促

2、進凋亡；而gC1qR與CRT形成CRT/gC1qR復合體則可阻止gC1qR線粒體和核轉(zhuǎn)位，促進細胞增殖或遷移。氧化應(yīng)激可影響CRT、gC1qR蛋白表達和亞細胞定位，但在表皮組織中，角質(zhì)形成細胞與黑素細胞應(yīng)對氧化損傷有不同模式，CRT、gC1qR的定位及功能變化尚不明確，CRT/gC1qR復合體的存在與否對兩種細胞的影響也亟待闡明。
　　課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)：過氧化氫（H2O2）誘導氧化應(yīng)激時，黑素細胞中的CRT翻轉(zhuǎn)至細胞膜表面，促

3、進部分炎癥因子的表達。提示白癜風發(fā)病早期，氧化應(yīng)激介導黑素細胞免疫原性增強，啟動并促進自身免疫應(yīng)答。但CRT膜外翻的具體機制尚不明確，更關(guān)鍵的是尚未獲得CRT參與黑素細胞免疫損傷的確切證據(jù)；另外，角質(zhì)形成細胞中相關(guān)分子的表達也值得關(guān)注?；谇笆鼋Y(jié)果，我們提出如下假說：氧化應(yīng)激誘導黑素細胞內(nèi)部顯著的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體應(yīng)激，導致CRT膜外聚集，gC1qR發(fā)生線粒體轉(zhuǎn)位，二者共同作用促進細胞凋亡；而角質(zhì)形成細胞中，CRT與gC1qR形成CRT/g

4、C1qR復合體，降低細胞損傷。
　　目的：
　　1.探討氧化應(yīng)激下調(diào)控CRT的信號通路及CRT在氧化應(yīng)激介導黑素細胞免疫損傷中的證據(jù)；
　　2.明確gC1qR、CRT/gC1qR復合體在黑素細胞和角質(zhì)形成細胞中的表達模式及參與氧化損傷的機制。
　　方法：
　　1.應(yīng)用激光共聚焦組織免疫熒光技術(shù)，觀察白癜風患者及正常人表皮黑素細胞中CRT定位的差異；
　　2.通過應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測細胞早凋/壞死比例，體

5、外構(gòu)建 H2O2誘導的黑素細胞及角質(zhì)形成細胞氧化應(yīng)激模型，應(yīng)用細胞免疫熒光技術(shù)觀察細胞模型中CRT的定位；
　　3.應(yīng)用Real-time PCR、western blot篩選上游調(diào)控CRT表達的信號通路；并通過干涉片段對初篩結(jié)果進行驗證，激光共聚焦組織免疫熒光技術(shù)觀察白癜風患者及正常人表皮中所篩選相關(guān)通路標志分子的表達；同時通過分離胞膜蛋白，進一步明確上游信號對亞細胞結(jié)構(gòu)中CRT的調(diào)控機制；
　　4.建立PIG1細胞與白癜

6、風患者PBMC共孵育模型，應(yīng)用流式細胞術(shù)及ELISA檢測不同條件處理后的共孵育模型中CD8+T細胞的增殖、細胞因子IFN-γ的表達水平、DC細胞成熟標志物CD80、CD86、HLA-DR的表達差異；
　　5.應(yīng)用Real-time PCR、western blot技術(shù)檢測細胞氧化應(yīng)激模型中g(shù)C1qR的表達，并應(yīng)用激光共聚焦免疫熒光觀察gC1qR的亞細胞器定位變化；
　　6.應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)分析氧化應(yīng)激模型中 CRT與 gC

7、1qR的相互作用及CRT/gC1qR復合體的形成，并通過western blot、細胞免疫熒光技術(shù)觀察CRT、gC1qR、CRT/gC1qR的表達與定位情況；
　　7.分別應(yīng)用 CRT與 gC1qR的干涉片段處理細胞后，觀察氧化應(yīng)激條件下二者及CRT/gC1qR復合體對細胞凋亡、線粒體膜電位及細胞ROS水平的影響；
　　8.通過質(zhì)譜分析及 STRING在線軟件對黑素細胞氧化應(yīng)激模型中影響CRT/gC1qR復合體形成的靶蛋白進

8、行預測和分析。
　　結(jié)果：
　　1.CRT生理、病理狀態(tài)的定位：
　　①正常人表皮組織中的黑素細胞CRT定位于胞漿；而白癜風表皮組織中殘留的黑素細胞CRT表達增加且于胞膜上出現(xiàn)CRT的定位；
　　②濃度梯度H2O2處理黑素細胞（PIG1、原代MC）及作為對照的角質(zhì)形成細胞（HaCaT、原代 KC）12h，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡并選擇早期凋亡有統(tǒng)計學差異而壞死無差異的H2O2濃度作為所構(gòu)建氧化應(yīng)激模型的實驗濃度，即

9、PIG1與原代MC細胞為：400μM，HaCaT及原代KC細胞為：800μM；本實驗濃度可以成功誘導黑素細胞中CRT與DiI標記的細胞膜共定位（CRT膜外翻/聚集），并可以在mRNA及蛋白水平以時間梯度依賴性誘導CRT的上調(diào)；角質(zhì)形成細胞中未見時間依賴性的CRT膜外翻。
　　2.氧化應(yīng)激誘導CRT與gC1qR表達與功能變化：
　　①H2O2構(gòu)建的黑素細胞氧化應(yīng)激模型引起gC1qR的表達上調(diào)及線粒體轉(zhuǎn)位，且具時間依賴性；與黑素

10、細胞不同的是，角質(zhì)形成細胞氧化應(yīng)激模型中g(shù)C1qR的表達下調(diào)，且主要表達于細胞漿，并未發(fā)生顯著的線粒體轉(zhuǎn)位；
　　②黑素細胞氧化應(yīng)激模型誘導的CRT膜聚集和gC1qR線粒體轉(zhuǎn)位，兩者在細胞內(nèi)無共定位現(xiàn)象；而角質(zhì)形成細胞氧化應(yīng)激模型則誘導部分CRT與gC1qR形成復合體。
　　3.CRT與gC1qR在氧化應(yīng)激損傷細胞中的機制：
　?、袤w外氧化應(yīng)激模型可以誘導黑素細胞未折疊蛋白反應(yīng)UPR發(fā)生的同時，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激經(jīng)典的信號

11、通路；其中PERK相關(guān)通路的激活主要調(diào)控了黑素細胞CRT的膜聚集，且具有顯著的時間依賴性；白癜風皮損旁組織與正常對照組織相比磷酸化PERK高表達；IREIα及ATF6相關(guān)通路的激活與黑素細胞膜型CRT的表達無關(guān)；
　?、隗w外與HLA分型一致的患者PBMC構(gòu)建的共孵育模型發(fā)現(xiàn)，黑素細胞CRT的膜聚集導致CD8+T細胞增殖并促進IFN-γ的產(chǎn)生；同時可以促進DC細胞表面成熟標志物CD86及HLA-DR的表達；
　?、垩趸瘧?yīng)激下，

12、黑素細胞中的CRT與gC1qR均參與細胞的凋亡，發(fā)揮促凋亡的作用，其中CRT主要導致細胞早期凋亡，gC1qR可以導致線粒體內(nèi)膜發(fā)生去極化、膜電位下降，并引起胞內(nèi)ROS的蓄積；與黑素細胞相反，角質(zhì)形成細胞中CRT/gC1qR復合體的形成阻止了CRT引起的細胞早凋、gC1qR誘導的線粒體膜電位下降及胞內(nèi)ROS的蓄積；SRSF1、NCAPD2、HSP90AA1、SCARF1、TUBB2C可能與黑素細胞CRT競爭結(jié)合gC1qR從而誘導細胞凋亡。