色素上皮衍生因子在慢性高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用.pdf

1、目的:
　　 慢性高糖會(huì)對(duì)機(jī)體的組織和器官造成損害，包括胰島β細(xì)胞。近年來(lái)“糖毒性學(xué)說(shuō)”收到廣泛關(guān)注，認(rèn)為：長(zhǎng)期暴露在高濃度的葡萄糖條件下胰島β細(xì)胞的胰島素分泌功能下降，胰島β細(xì)胞減少，且呈不可逆性改變。研究表明其機(jī)制是高糖誘導(dǎo)胰島細(xì)胞胞內(nèi)氧化應(yīng)激而造成胰島β細(xì)胞氧化損傷。PEDF是一種內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激分子。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究顯其與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病如：代謝綜合癥，腹型肥胖，糖尿病腎病等關(guān)系密切，一些基礎(chǔ)研究也表明PEDF可在

2、多種細(xì)胞中通過(guò)不同途徑發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激性能，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。然而在胰島細(xì)胞中的研究未見報(bào)道，本研究旨在明確、探討：1）不同糖濃度孵育，對(duì)INS-1E細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生、細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡率及糖刺激的胰島素分泌功能的影響；2）PEDF是否能夠改善高糖誘導(dǎo)的INS-1E細(xì)胞氧化損傷。
　　 材料與方法:
　　 1)INS-1E細(xì)胞種盤次日，以無(wú)糖PRMI1640培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞2h，按葡萄糖濃度分為5.6mmol/l組（對(duì)

3、照組），16.7mmol/l組,30mmol/l組，并以甘露醇(mannitol)調(diào)節(jié)滲透壓，即5.6mmol/lglucose+24.4mmol/lmannitol、16.7mmol/lglucose+13.3mmol/lmannitol、30mmol/lglucose，分別用5.6G、16.7G、30G表示。三個(gè)梯度糖濃度培養(yǎng)基處理細(xì)胞48h后，DCFH-DA探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量；MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性；PI/Hoechst法檢測(cè)

4、細(xì)胞凋亡率；GSIS（去培養(yǎng)基→清洗細(xì)胞→2.5mmol/lglucose的KRBH平衡30min→清洗→16.7mmol/lglucose的KRBH刺激30min)處理、收集上清，ELISA檢測(cè)葡萄糖刺激的胰島素分泌。比較不同濃度高糖處理對(duì)以上指標(biāo)的影響。
　　 2)RT-PCR檢測(cè)大鼠腎、胰島、腺泡及INS-1E細(xì)胞內(nèi)PEDFmRNA水平。
　　 3)構(gòu)建PEDF質(zhì)粒，在INS-1E細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染PEDF質(zhì)粒并檢測(cè)

5、其蛋白表達(dá)，確定轉(zhuǎn)染是否成功。
　　 4)細(xì)胞種盤次日轉(zhuǎn)染，分組為：5.6G、16.7G、30G三組，同一糖濃度根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的不同分為GS(glucose+scramble)，GP(glucose+PEDF)兩組，即5.6GS,5.6GP，16.7GS，16.7GP,30GS,30GP六組。轉(zhuǎn)染后24h（PEDF蛋白表達(dá)高峰）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行2h饑餓處理，其后分別用三種糖濃度培養(yǎng)液孵育細(xì)胞48h，同上方法檢測(cè)，比較同一糖濃度組內(nèi)，GP

6、與GS組細(xì)胞內(nèi)ROS含量、細(xì)胞活性、凋亡率及GSIS差異。（scramble以空質(zhì)粒載體替代）
　　 結(jié)果:
　　 1)高糖(16.7G、30G)培養(yǎng)基處理48h后INS-1E細(xì)胞胞內(nèi)ROS含量、細(xì)胞凋亡率顯著增加，細(xì)胞活性、胰島素分泌功能顯著降低，并呈濃度依賴性。
　　 2)在大鼠腎、胰島、腺泡及INS-1E細(xì)胞內(nèi)，PEDF的mRNA水平差異顯著，其中INS-1E細(xì)胞內(nèi)其mRNA微乎其微。
　　 3)以

7、2ugPEDF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染INS-1E細(xì)胞，其24、48、72h蛋白過(guò)表達(dá)均較顯著，過(guò)表達(dá)有效。
　　 4)較之16.7GS、30GS組，對(duì)應(yīng)的16.7GP、30GP組細(xì)胞內(nèi)ROS含量、細(xì)胞凋亡率顯著降低，細(xì)胞活性、GSIS顯著改善，均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.6mM糖濃度組，PEDF轉(zhuǎn)染對(duì)上述指標(biāo)無(wú)顯著影響。
　　 結(jié)論:
　　 本研究初步揭示了高糖可致INS-1E細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加，并伴隨著細(xì)胞凋亡增加、細(xì)胞活性及胰島