Ras-GTP酶蛋白RASAL2對卵巢癌上皮間質轉化與轉移的調控作用以及相關機制的研究.pdf

1、上皮性卵巢癌（EOC）是最常見的婦科惡性腫瘤之一，也是女性第五大癌癥死亡原因。2015年，在全美預計的新發(fā)病人數(shù)與死亡人數(shù)分別為21,290與14,180。其中50％以上的卵巢癌患者年齡超過65周歲。因此卵巢癌是目前威脅女性健康的首要疾病之一。上皮間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細胞逐漸失去其代表性的細胞極性與細胞間連接，而獲得間質細胞所具有的侵襲與遷移能力的過程。目前普遍認為

2、上皮間質轉化參與癌癥轉移的起始過程，促進癌癥細胞離開原始位置向遠端散播。卵巢癌是轉移高發(fā)癌癥，EMT對卵巢癌轉移的調控作用已有較多報道，然而卵巢癌EMT的調控機制尚不清晰。
　　細胞外信號利用多種跨膜信號傳遞通路調控細胞內的生物過程。Ras-GTP酶正是介導這些信號傳遞通路的關鍵分子。Ras蛋白（H-Ras，N-Ras，and K-Ras），是 Ras-GTP酶家族最重要的蛋白。其生物學功能被兩種相反功能的蛋白調控，鳥嘌呤核酸交換

3、因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）和GTP酶活化蛋白（GTPase-activating proteins，GAPs）。RASAL2是一種近期新發(fā)現(xiàn)Ras-GAP。有報道稱其在乳腺癌中具有抑癌作用。但其具體生物學功能尚不明確。本研究卵巢癌細胞系為模型，并輔以卵巢癌患者樣本，旨在探索RASAL2在卵巢癌的發(fā)生與轉移中的作用與機制，并期望以此提出新的卵巢癌治療靶點。
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4、例卵巢癌患者腫瘤樣本cDNA以及8例正常卵巢組織樣本cDNA分析發(fā)現(xiàn)，雖然RASAL2的表達與卵巢癌患者的年齡和組織學分型無關，但其與卵巢癌的病理分級以及臨床分期顯著相關。提示RASAL2在卵巢癌中可能作為一種抑癌因子發(fā)揮作用。我們在三種卵巢癌細胞系 SKOV3，OVCAR3和A2780中分別敲低了RASAL2的表達。利用軟瓊脂集落形成實驗，侵襲與遷移實驗，裸鼠體內成瘤實驗等對RASAL2在卵巢癌生物學中作用進行了初步探索。實驗結果顯示

5、，RASAL2敲低促進卵巢癌細胞軟瓊脂集落形成以及體內成瘤能力。而且細胞體外侵襲與遷移能力都有顯著提升。這說明RASAL2在卵巢癌中具有抑癌作用，特別是具有抑制侵襲遷移能力。
　　EMT常被癌癥利用從而促進其自身轉移。我們利用qPCR，免疫印記與免疫熒光實驗檢測了RASAL2敲低對卵巢癌細胞EMT標志分子的分布與表達的影響。并且對卵巢癌細胞裸鼠成瘤模型樣本進行免疫組織化學染色或免疫印記實驗檢測其 EMT標志分子表達變化。實驗結果表

6、明，RASAL2敲低可以顯著降低上皮表型蛋白的表達，與之相反的，間質表型標志蛋白卻發(fā)生顯著上調。免疫熒光實驗顯示E-cadherin在細胞表面聚集減少，而vimentin卻發(fā)生上調。體內EMT標志蛋白檢測實驗結果與體外一致。上皮表型蛋白的表達在RASAL2敲低后下調，而間質表型標志蛋白發(fā)生上調。此外，我們檢測了卵巢癌患者cDNA中RASAL2與EMT的表達，并進行了相關性分析。結果顯示，RASAL2的表達與E-cadherin呈現(xiàn)正相關

7、。這些結果說明在卵巢癌中RASAL2是EMT的負向調控因子。
　　由于RASAL2屬于Ras-GAP蛋白家族。其發(fā)揮調節(jié)抑癌與抑制EMT作用很可能是通過抑制 Ras-ERK信號通路完成的。因此我們檢測了RASAL2敲低對Ras-ERK通路活化狀態(tài)的影響。結果顯示在體外RASAL2下調后，Ras-GTP，p-Raf-1，p-MEK1/2和p-ERK1/2等Ras-ERK核心調控蛋白都發(fā)生上調。在體內，免疫組化以及免疫印記實驗顯示，R

8、ASAL2敲低卵巢癌組織表現(xiàn)出與體外實驗一致的結果。這提示 RASAL2可能具有抑制 Ras-ERK通路活性的功能。另外，利用MEK抑制劑PD98059體外抑制ERK活化后，RASAL2敲低所介導的軟瓊脂集落形成，侵襲遷移能力增強以及 EMT都發(fā)生了逆轉。這些是實驗結果共同表明RASAL2對卵巢癌的抑癌作用以及EMT的抑制作用可能是依賴于其Ras-ERK活化作用。
　　綜上，我們證實RASAL2是卵巢癌的抑癌因子，特別是抑制卵巢癌