Ha-PTX-P85-SLN對宮頸癌和乳腺癌多藥耐藥性影響的研究.pdf

1、第一部分HA-PTX-P85-SLN對宮頸癌和乳腺癌多藥耐藥性影響的研究
　　研究目的:
　　當今社會，人類生命和健康日益受到來自癌癥的嚴重威脅。在我國城市居民的死因中，癌癥在各種類型疾病的死亡率中占比達到25％?；瘜W藥物治療可以通過藥物進行全身范圍內的治療，因而成為臨床上應用最廣泛的治療手段之一。而腫瘤多藥耐藥性是阻礙腫瘤化療進程和預后的最嚴重的問題。臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計表明，乳腺癌和宮頸癌是威脅女性健康的兩大主要殺手，近年來這兩

2、種疾病的發(fā)病率和死亡率逐漸上升，并明顯趨向年輕化。因此，如何有效的預防和治療這兩種癌癥就成為重中之重。
　　普朗尼克，是一類結構為聚氧乙烯(PEO)-聚氧丙烯(PPO)-聚氧乙烯(PEO)的三嵌段共聚物，可以于水溶液中利用本身攜帶的親水端和疏水端自組裝成膠束載體系統(tǒng)，近年來成為廣大學者密切關注的熱點問題。普朗尼克作為靶向遞藥系統(tǒng)的載體，其最大的不足在于它的臨界膠束濃度比較低，因此在血液循環(huán)中容易被稀釋，故而它易分解且不穩(wěn)定，這就極

3、大限制了單獨采用普朗尼克作為載體在臨床上的應用。如何克服普朗尼克膠束稀釋后的不穩(wěn)定性可？通過將普朗尼克與其它材料通過化學交聯(lián)的方法制成穩(wěn)定性膠束，提高膠束系統(tǒng)在臨床治療上的應用價值。
　　紫杉醇是其中一種用來治療乳腺癌和宮頸癌腫瘤細胞常用的化療藥物之一。但是它的長期治療容易引起腫瘤細胞的耐藥性，嚴重影響腫瘤的預后效果。研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇是多藥耐藥基因編碼的P-gp糖蛋白的底物之一。但是紫杉醇具有強烈的疏水性能，在人體血液中，幾乎無法

4、溶解，使其在臨床治療中的應用受到很大的限制。臨床上現(xiàn)在唯一可以得到的制劑即以聚氧乙烯蓖麻油為助溶劑，與無水乙醇按1∶1體積比混合制成Taxol，但制劑中的聚氧乙烯蓖麻油會產生比較嚴重的毒副作用以及過敏反應。因此，如何將紫杉醇安全越過腫瘤的多藥耐藥性，并有效的發(fā)揮其作用，是科學家們一直努力解決的問題之一。
　　透明質酸是一種大分子糖胺聚糖，是構成細胞外基質和細胞間質的主要成分。在合適的環(huán)境下，如在生理條件或適宜PH，HA分子中糖醛酸

5、的羧基可以進行充分解離，并與正離子結合形成離子對。在機體內，HA通過與其受體CD44結合，并利用本身的黏性及高度水合性來發(fā)揮其重要作用。CD44是迄今發(fā)現(xiàn)的HA四種受體之一，既是一種黏附分子，也是一組跨膜糖蛋白，功能和結構很復雜，宮頸癌和乳腺癌的腫瘤細胞表面廣泛存在，與腫瘤的某些生物學特性如生長、浸潤、轉移密切相關。
　　本課題利用高分子材料-普朗尼克，制備一種納米給藥系統(tǒng)，不但在體內循環(huán)系統(tǒng)中可以穩(wěn)定存在、耐稀釋，同時能主動將化

6、療藥物靶向細胞內的。通過化學交聯(lián)的方法，將普朗尼克P85與DSPE交聯(lián)，形成穩(wěn)定的固體脂質納米粒;利用透明質酸可特異結合腫瘤細胞表明CD44的特點，在納米粒表面連接上透明質酸，制備靶向遞藥載體;通過細胞實驗和動物實驗驗證所制備的納米靶向給藥系統(tǒng)對耐藥腫瘤細胞的細胞毒性作用以及在體內的抗腫瘤效果。
　　研究方法:
　　1.普朗尼克P85-DSPE的合成
　　實驗通過化學合成的方法，將普朗尼克P85與二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(

7、distearoylphosphoethanolamine，DSPE)在1，10-羰基二咪唑(1，10-carbonyldiimidazole，CDI)的催化作用下偶聯(lián)合成P85-DSPE。
　　2.固體脂質納米粒SLN的制備
　　通過熱乳勻法和正負電子力相互作用來制備固體脂質納米粒。首先，將GMS，P85-DSPE(5∶1，w/w)和紫杉醇PTX在70度熱乙醇中融化、溶解以形成脂相。另外，通過在純水中溶解DOTAP(0.2

8、％，w/v)和Poloxamer188(0.1％，w/v)形成水相，同時加熱到與脂相相同的溫度。然后將脂相逐滴加入到水相中。溫和攪拌混合物10分鐘，用高壓乳勻機循環(huán)乳勻3-5次，持續(xù)攪拌直到溶劑完全蒸發(fā)，即得PTX-P85-SLN。
　　而HA-PTX-P85-SLN的制備是將1mlPTX-P85-SLN納米分散劑逐滴加到透明質酸HA(0.03％,w/v)中，并且不斷溫柔攪拌。30分鐘后，在HA和SLN之間形成的正負電子力促使形成

9、HA-PTX-P85-SLN。
　　3.固體脂質納米粒SLN穩(wěn)定性的鑒定
　　通過平均直徑、zeta電勢、表型、藥物包封率、藥物裝載能力和體外藥物釋放實驗來評價制備的PTX裝載的SLN的物理性質。利用ZetasizerNanoZS90(MalvernInstruments，UK)進行動態(tài)光散射來測定SLN的載體大小和電勢。通過高效液相色譜法測定SLN的藥物包封率(EE)和藥物裝載能力(LC)。同時通過透析的方法測定從SLN釋

10、放出來的PTX的數(shù)量。
　　4.HA-PTX-P85-SLN對乳腺癌和宮頸癌腫瘤細胞的作用
　　通過流式細胞分析檢測腫瘤細胞對HA-PTX-P85-SLN的攝取能力。通過MTT法來檢測HA-PTX-P85-SLN對腫瘤細胞的毒性。同時，在健康的雌性BALB/c小鼠中建立Hela/PTX腫瘤模型。將腫瘤模型小鼠隨機分成5組，生理鹽水對照組、游離PTX處理組，PTX-SLN處理組，PTX-P85-SLN處理組，HA-PTX-P8

11、5-SLN處理組。以10mgPTX/kg的劑量隔天尾靜脈注射。同時，測量腫瘤的體積和小鼠重量。收集不同時間點采集的血液樣本，進行藥物動力學分析。同時，收集藥物處理24小時后小鼠的各個臟器和腫瘤組織，進行生物分布檢測。
　　研究結果:
　　結果發(fā)現(xiàn)，我們制備的HA-PTX-P85-SLN復合物，于透射電子顯微鏡下進行觀察，顯示不僅分散性好，圓整并且均勻而不粘連。其平均粒徑為160.3nm，具有負的zeta電勢(-31.6mv)

12、，藥物包封率為88.2％，藥物裝載能力為4.9％。與游離PTX相比，HA-PTX-P85-SLN遞藥載體表現(xiàn)出較長的藥物釋放時間，在其前期藥物釋放階段速度很快，即快速釋藥，進入后期轉為緩慢釋藥階段。這種釋放藥物的特點與抗腫瘤藥物的用藥原則是相一致的，即在到達靶向部位后，納米?？焖籴尫懦鲚^多藥物，以較高藥物濃度達到治療作用，進入后期則將剩余藥物緩慢釋放，可使藥物得以在到達靶部位后維持較高的有效藥物濃度，從而將治療作用維持時間有效延長。

13、r>　　HA-PTX-P85-SLN的細胞攝取效率大大超過其它SLNs(p＜0.05);HA-PTX-P85-SLN對Hela/PTX細胞的細胞毒性大大超過其它SLNs(IC50值為0.2nmol/ml);HA-PTX-P85-SLN處理組小鼠的腫瘤生長率維持較低的水平，具有顯著抑制腫瘤生長的能力，且不會造成處理組小鼠的體重降低。
　　藥物動力學分析結果表明，游離的PTX在3小時內迅速的從血清中消失，而PTX裝載的SLN則表現(xiàn)出緩

14、慢的降低（持續(xù)到24小時才完全消失）。游離PTX和HA-PTX-P85-SLN的半衰期(t1/2β)分別為2.23±0.09h和13.12±0.82h、平均停留時間(MRT)分別為1.26±0.52h和8.17±0.85h、機體清除率(CL)分別為0.71±0.06L/h/kg和0.17±0.01L/h/kg以及血清濃度與時間曲線面積(AUC0～∞)分別為12.89±2.37μg*h/mL和59.33±6.39μg*h/mL。結果證明:

15、HA-PTX-P85-SLN納米粒經靜脈途徑注射給藥后，藥物在體內的滯留時間不但可顯著延長，同時由于將藥物緩慢釋放，使藥物可以發(fā)揮長效作用。
　　由小鼠體內組織分布試驗表明，HA-PTX-P85-SLN經尾靜脈注射后，藥物在各組織器官的分布發(fā)生了改變。結果顯示，HA-PTX-P85-SLN和PTX-P85-SLN或游離PTX相比，在腫瘤組織中的藥物濃度分別增加了5.5倍和4.1倍。另外，PTX裝載的SLN在肝臟和肺臟中的藥物濃度高

16、于游離的PTX，而它們在心臟和腎臟中的藥物濃度要顯著性低于游離的PTX(p＜0.05)，說明將藥物制成納米粒后具有明顯的肝、肺靶向性。
　　結論和創(chuàng)新性:
　　綜上所述，本研究表明透明質酸裝飾普朗尼克P85固體脂質納米粒對宮頸癌和乳腺癌腫瘤細胞具有更強的細胞毒性，以及對抗宮頸癌和乳腺癌腫瘤多藥耐藥性的能力。
　　與游離的PTX相比，HA-PTX-P85-SLN表現(xiàn)出增強的對耐藥腫瘤細胞的細胞毒性，并且表現(xiàn)為劑量依賴效應

17、。這可能是增強的靶向傳遞PTX到腫瘤細胞的效果。有許多因素都能影響細胞內增加的PTX濃度:如SLN的EPR、化療劑P85、以及活化的靶受體的配體HA。研究報道，P85能夠通過抑制腫瘤細胞對藥物的外排作用，降低腫瘤細胞的MDR。而HA裝飾的納米質?？梢詫⒒焺┌邢騻鬟f到腫瘤細胞中，從而降低有效藥物使用的劑量來克服MDR。通過分別比較游離的PTX以及PTX裝載的SLN對Hela/PTX和Hela、MCF-7/PTX和MCF-7細胞的毒性實驗

18、，進一步表明腫瘤對HA裝飾的P85包被的SLN能夠客服腫瘤耐藥細胞的MDR，實現(xiàn)更好的腫瘤耐藥細胞的靶向治療。
　　為了確定PTX裝載的SLN能夠更加安全有效的到達腫瘤組織，我們分析了腫瘤小鼠處理組的腫瘤大小和體重情況。已有的研究報道，HA裝飾的脂質納米質粒能夠延長藥物在血清中的循環(huán)時間并且可以增加藥物在腫瘤組織中的累積，從而具有更強的體內抗腫瘤能力。我們的研究結果發(fā)現(xiàn)，與游離的PTX相比，PTX-P85-SLN和HA-PTX-P

19、85-SLN都表現(xiàn)出顯著的腫瘤生長抑制能力。進一步的補充證明將HA的靶向能力和P85的抗腫瘤能力相結合的優(yōu)勢。這些結果與先前的體外細胞毒性實驗相一致，都提示了HA-P85-SLN可以成為治療MDR腫瘤細胞的新的工具。
　　藥物動力學和生物分布更進一步的說明與PTX-P85-SLN相比，HA-PTX-P85-SLN具有最大的AUC，MRT和腫瘤組織藥物濃度值(p＜0.05)。在腎臟和心臟中檢測到降低的PTX裝載的SLN藥物濃度表明用

20、PTX裝載的SLN治療腫瘤，其毒副作用也是大大降低的，且更具有顯著的靶向性。
　　因此，我們制備的HA-PTX-P85-SLN可作為宮頸癌和乳腺癌治療的潛在的靶向遞藥載體，為腫瘤耐藥細胞的靶向治療提供新的研究思路。
　　第二部分惡性腫瘤患者術后絕經綜合征的藥物治療
　　研究目的
　　隨著檢測技術的不斷進步，惡性腫瘤的檢出比例顯著提高，同時腫瘤發(fā)病年齡趨于年輕化，發(fā)病于絕經期前或圍絕經期的病例所占比例顯著上升。通過

21、手術盡可能切除患癌組織并輔以放、化療，致雌激素水平迅速下降，絕經癥狀提前出現(xiàn)，嚴重影響患者的身心健康，并降低患者治療的信心。
　　激素替代治療(HRT)是緩解絕經相關癥狀的有效方案。其作用也是其他藥物無法替代的，然而對于HRT利弊的爭論，從未停止，一直是醫(yī)學專家們研究的焦點。雖然HRT是治療絕經綜合征相關癥狀的首選治療手段，但越來越多的患者開始擔心應用HRT可能會帶來的副作用。目前婦科惡性腫瘤術后采用HRT也存在爭議，因此對于專科

22、醫(yī)生而言，更應以嚴謹?shù)膽B(tài)度對待HRT在婦科腫瘤術后病人中的應用。
　　由于傳統(tǒng)上對激素類藥物的恐懼心理，HRT應用在我國并不普及。他們更愿意去尋求其他的天然藥物和方法來緩解絕經相關癥狀。傳統(tǒng)中藥治療絕經綜合征在我國由來已久，也頗有療效。從發(fā)表文獻來看，坤泰膠囊被醫(yī)生用于更年期相關疾病，卵巢早衰等疾病，且收到很好的療效。但對那些發(fā)病于絕經期前或圍絕經期的婦科惡性腫瘤患者，接受了腫瘤根治術并切除了雙側卵巢，或輔以放化療的過程中出現(xiàn)絕經

23、綜合征相關癥狀，應用坤泰膠囊是否亦存在很好的療效未有詳細的研究，因此，將中成藥坤泰膠囊應用于婦科惡性腫瘤患者術后絕經綜合征相關癥狀的治療，并對其療效進行觀察和分析，為這類患者的臨床治療提供一個新的研究方向，以期找到更加安全可靠有效的HT替代治療藥物，提高腫瘤患者術后生存質量，具有重要臨床意義。本研究通過監(jiān)測口服坤泰膠囊后患者血清中FSH、E2水平的變化，KMI癥狀評分的改變，研究坤泰膠囊對婦科惡性腫瘤患者絕經綜合征癥狀改善的臨床應用價值

24、。
　　研究方法
　　1.一般資料
　　所有病例均來源于2014年7至2016年1月，山東省立醫(yī)院婦科，發(fā)病于絕經期前或圍絕經期的婦科惡性腫瘤患者，接受了腫瘤根治術并切除了雙側卵巢，或輔以放化療的過程中出現(xiàn)絕經綜合征相關癥狀，120例，按隨機數(shù)字表法分為實驗組和對照組，每組各60例。
　　2.病例入選標準
　　婦科惡性腫瘤患者發(fā)病于絕經期前或圍絕經期，接受過放療/化療/雙側卵巢切除手術，并出現(xiàn)絕經綜合征的婦

25、女，年齡20-45歲。
　　(1)血管舒縮癥狀，主要表現(xiàn)為潮熱、盜汗;
　　(2)自主神經失調癥狀，如心悸、眩暈、頭痛、失眠、耳鳴等;
　　(3)神經精神癥狀，注意力不集中、情緒波動大、激動易怒、情緒低落、抑郁、不能自我控制、記憶力減退等癥狀。
　　3.排除標準:
　　(1)不符合納入標準;
　　(2)合并有嚴重的心腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等疾病及精神病患者;
　　(3)合并乳腺腫瘤的患者;

26、r>　　(4)過敏體質或對坤泰膠囊組成成分過敏者，
　　(5)隨訪中無法判斷療效或隨訪資料不全影響療效判斷的患者。
　　(6)近3個月內，使用過含有性激素的藥物或營養(yǎng)品。
　　4.治療方法
　　實驗組:飯后一個半小時口服坤泰膠囊，4粒/次，3次/天，連續(xù)服用12周。對照組:飯后一個半小時口服坤泰膠囊安慰劑，4粒/次，3次/天，連續(xù)服用12周。隨訪12周，三次隨訪時間分別是初診及治療后第4、12周。
　　5.

27、觀察指標與方法
　　5.1安全性指標
　　患者用藥前、連續(xù)服藥第4周，第12周，進行安全性監(jiān)測項目。
　　5.1.1一般體檢項目:心率、血壓
　　5.1.2血、尿、便常規(guī)檢測
　　5.1.3心電圖、肝功能(ALT)、腎功能(Cr，BUN)檢查
　　5.2療效評價指標
　　5.2.1采用改良的Kupperman絕經指數(shù)評分(KMI)評分內容包括潮熱出汗、感覺異常（耳鳴、麻木、刺痛）、失眠、情緒波動

28、、抑郁、頭暈、疲乏、骨關節(jié)痛、頭痛、心悸、皮膚蟻走感，泌尿系感染及性生活等共13項。每種癥狀分按無、輕、中、重程度分別為0、1、2.3分。癥狀指數(shù)是恒定的，潮熱出汗為4，感覺異常、失眠、易激動、性交痛為3，泌尿系統(tǒng)癥狀為2，其余是1，單項評分=癥狀程度分×癥狀指數(shù)（加權分），總分為每個單項評分的總和。評分越高癥狀越明顯。
　　5.2.2血清雌二醇(E2)及促卵泡激素水平(FSH)水平
　　實驗組與對照組患者均于用藥前、連續(xù)用

29、藥第4周，第12周清晨空腹采集靜脈血2毫升，2h內分離出血清，保存于--70℃冰箱，電化學發(fā)光法檢測標本中的E2，F(xiàn)SH水平。
　　6.統(tǒng)計學方法
　　采用SPSS11.0和SAS9.2軟件進行統(tǒng)計分析。其中，計數(shù)資料用卡方檢驗;計量資料用t檢驗，兩組樣本進行均數(shù)比較時采用獨立樣本t檢驗，服用藥物前后的比較則使用配對樣本t檢驗，P＞0.05為無顯著性差異，P＜0.05有顯著性差異，有統(tǒng)計學意義。
　　結論
　　1

30、.坤泰膠囊在婦科惡性腫瘤患者伴隨絕經癥狀時，持續(xù)用藥時間與藥物臨床療效具有相關性，服藥第12周患者血清性激素FSH顯著下降，E2明顯上升。
　　2.坤泰膠囊在治療第4周，患者感覺異常、失眠、心悸、頭暈癥狀顯著改善，第12周時潮熱出汗明顯好轉。
　　3.口服坤泰膠囊，可以作為惡性腫瘤患者激素治療的替代治療方式，改善絕經綜合征癥狀同時提高生存質量。
　　討論
　　婦科惡性腫瘤患者，發(fā)病于絕經期前或圍絕經期者，在接受手

31、術治療切除了卵巢，或接受放化療之后，絕經癥狀出現(xiàn)的更早，并且程度更劇烈。目前公認，HRT治療可以有效緩解絕經癥狀。然而，惡性腫瘤患者是否可以安全的使用HRT則存在較大爭議，所以越來越多的患者傾向于選擇中藥進行治療。
　　從中醫(yī)學理論認為，坤泰膠囊由熟地黃、黃連、白芍、黃芩、阿膠、茯苓組成，六味藥合用組方，共同起到了滋陰清熱、安神除煩之功效。滋陰養(yǎng)血，益精填髓，清心除煩，調節(jié)陰陽平衡。張邵芬認為坤泰膠囊可以使卵巢體積增大，黃體數(shù)增加