棉鈴蟲HaCHS和CDA基因的克隆、表達及FeedingRNAi分析.pdf

1、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）是棉花的重要害蟲，采用種植Bt棉和化學方法進行防治導致害蟲出現(xiàn)抗性等一系列問題。RNAi技術因具有特異和高效的特點，而成為新型的害蟲防治策略。靶基因的選擇是成功的重要關鍵之一。幾丁質是昆蟲表皮和圍食膜的主要成分之一，植物和高等動物中不存在；其代謝是昆蟲的重要生化代謝過程之一。因此幾丁質代謝相關基因有可能是RNAi技術防治害蟲的理想靶標，具有重要的研究價值。本研究以棉鈴蟲體內的幾丁質代謝相

2、關基因CHS和CDA作為靶標基因，對其進行基因克隆和表達特征分析，并采用RNAi技術對其表型進行分析。從而為實現(xiàn)棉鈴蟲的有效控制提供科學依據(jù)。
　　本研究主要內容包括：⑴棉鈴蟲幾丁質合酶基因的克隆與表達分析⑼通過RT-PCR技術首次在棉鈴蟲克隆出兩個幾丁質合酶基因：HaCHS1和HaCHS2；并得到了HaCHS1的兩個剪接變體，分別命名為HaCHS1A和HaCHS1B。HaCHS1的兩個交替外顯子序列，只有177bp的差異，核苷酸

3、和氨基酸水平上相似度分別為64％和69%。HaCHS1讀碼框4698 bp，編碼1565個氨基酸；HaCHS2讀碼框4587bp，編碼l528個氨基酸。RT-qPCR結果顯示：HaCHS2只在腸道表達，在前腸中表達量最高，其次是中腸和后腸，而在其他組織則表達量極低；HaCHS1A主要在表皮中高表達，前腸和后腸也檢測到少量的表達，而HaCHS1B在表皮，前腸和后腸中都高表達。HaCHS1A和HaCHS1B在幼蟲期，蛹期和蛾期都有表達，其中

4、蛹期表達量最高；而HaCHS2基因在卵期和幼蟲期表達量高。⑵棉鈴蟲幾丁質脫乙酰基酶2基因的克隆與表達分析⑼克隆了棉鈴蟲四個幾丁質脫乙?；富颍℉aCDA1，HaCDA2，HaCDA5a和HaCDA5b），其中HaCDA2為新基因，該基因ORF為1611 bp，編碼536個氨基酸，推測的蛋白分子量約為60.78 kDa，理論等電點為5.31?；谛蛄斜葘σ约跋到y(tǒng)發(fā)育確認HaCDA2基因屬于幾丁質脫乙酰基酶1家族。RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)：

5、HaCDA2基因只在脂肪體高表達；HaCDA2基因在幼蟲期和蛹期表達量高。⑶目的基因RNAi干擾效率檢測及表型觀察。分別構建表達HaCHS、HaCDA的dsRNA的載體；用表達dsRNA（HaCHS1、HaCHS1A、HaCHS1B、HaCHS2、HaCDA1、HaCDA2、HaCDA5a和HaCDA5b）的HT115菌液喂食。RT-qPCR檢測喂食處理2 d的幼蟲發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲的靶標基因表達量都出現(xiàn)了下調，但是下降的幅度不同（以對照為1