棉鈴蟲離子型受體的基因克隆、表達定位及功能研究.pdf

1、昆蟲主要依賴靈敏的嗅覺系統識別環(huán)境中的各種化學物質，這些化學信號經進一步加工整合最終引發(fā)特定的行為反應，如定位寄主植物、選擇產卵場所等。在嗅覺識別過程中，多種化學感受相關蛋白參與到其中。隨著棉鈴蟲觸角轉錄組和基因組的測序完成，多種嗅覺感受相關的蛋白相繼被鑒定。目前，對于棉鈴蟲嗅覺相關蛋白的研究主要集中在氣味受體和氣味結合蛋白上，而離子型受體作為另一類嗅覺受體，其功能尚未被揭示。本研究在棉鈴蟲觸角轉錄組測序和分析的基礎上，克隆了6個離子型

2、受體基因并分析了它們的序列結構，對HarmIR8a和HarmIR25a在觸角中的表達位置進行了定位研究，記錄了棉鈴蟲腔錐形感器神經元的功能，并對離子型受體的體外功能進行了初步鑒定。為深入研究棉鈴蟲化學識別機制、尋找新的防治靶標以及發(fā)展綠色行為調控劑提供了一定的分子基礎。主要結果如下:
　　1.利用PCR和RACE技術，克隆了6棉鈴蟲離子型受體全長序列，包括HarmIR8a,HarmIR25a，HarmIR21a,HarmIR41a

3、,HarmIR76b和HarmIR64a。
　　2.利用生物信息學方法對上述6個棉鈴蟲離子型受體氨基酸序列、跨膜結構域及保守功能域等進行了分析。氨基酸序列比對結果顯示，HarmIR8a和HarmIR25a與其它昆蟲種群對應氨基酸的相似度較高，相對保守;而HarmIR21a，HarmIR41a，HarmIR76b和HarmIR64a與其它種群相比保守性相對較低。對HarmIR8a和HarmIR25a蛋白結構分析結果顯示，其均含有一個

4、N端的氨基酸末端區(qū)域(ATD)，跨膜域(M1，M2和M3)，一個離子通道(P)，一個由S1和S2組成的配體結合域和一個胞內C端。
　　3.利用熒光定量qPCR技術檢測了HarmIR8a，HarmIR25a,HarmIR76b,HarmIR21a，HarmIR41a和HarmIR64a分別在棉鈴蟲雌雄成蟲8個組織中的相對表達量。結果表明HarmIR8a在棉鈴蟲雌雄蟲的頭部、觸角等組織中均有表達，而且在雌雄蟲觸角中高表達;HarmIR

5、25a在雌、雄蟲觸角中表達量最高，在其它組織中表達量較低。HarmIR76b除觸角中高表達外，在喙等部位表達量也較高;HarmIR64a在所有組織中均有表達，其中在觸角等中表達量相對較高;同時HarmIR21a和HarmIR41a均在觸角中高表達。
　　4.利用原位雜交技術初步明確了HarmIR8a和HarmIR25a在棉鈴蟲觸角感受器中的表達定位。結果表明2個離子型受體主要在棉鈴蟲觸角的腔錐形感器下表達，在其它感器（毛形感器、錐

6、形感器、刺形感器等）中未檢測到雜交信號。
　　5.利用單細胞記錄技術，對棉鈴蟲觸角腔錐形感器的神經元功能進行了鑒定。結果表明，經記錄的腔錐形感器神經元對酸類、胺類、醛類及酯類等氣味物質均有電生理反應，但是對兩種萜烯類化合物（檸檬烯和α-蒎烯）均沒有電生理反應。同時將棉鈴蟲觸角腔錐形感器劃分為4個功能亞型，包括TypeA，Type B，Type C和TypeD型，每個亞型中神經元的功能有一定的分化。
　　6.利用爪蟾卵母細胞結