次氯酸修飾白蛋白對單側輸尿管梗阻大鼠腎臟線粒體功能及腎間質纖維化的影響.pdf

1、目的：本研究以大鼠單側輸尿管結扎為腎間質纖維化模型，旨在驗證我們提出的假說:HOCl-alb誘導線粒體氧化應激損傷，促使線粒體功能障礙，促進腎小管上皮細胞凋亡，進一步加速腎間質纖維化，SS肽可能減輕HOCl-alb所致的腎臟線粒體氧化損傷，從而起到了保護腎臟的作用。
　　方法：一、無內毒素HOCl修飾的大鼠血清白蛋白(HOCl-RSA)的制備和鑒定:將純化的無內毒素大鼠血清白蛋白(RSA)溶液與HOCl(200 mmol/L)按照

2、1∶140摩爾比混合，室溫避光孵育30分鐘。制備的HOCl-RSA裝入透析袋，在4℃無菌PBS溶液中透析24小時，每隔4-6小時換一次新配制的無菌PBS溶液，以去除游離的次氯酸。透析結束后，用除菌濾器過濾除菌，應用內毒素去除膠柱去除內毒素。配制過程中所有玻璃器皿均經(jīng)180℃烘烤4小時去內毒素處理。利用鱟試驗法內毒素檢測試劑盒檢測制備的HOCl-RSA內毒素水平，并證實內毒素水平低于0.025 Eu/ml。體外制備的HOCl-RSA濃度為

3、5.3±0.4 nmol/mg蛋白質，對照樣本的HOCl-RSA含量為0.2±0.03 nmol/mg蛋白質。
　　二、SS肽的合成和進入線粒體的鑒定
　　1.SS肽的合成
　　SS肽由杭州中肽公司協(xié)助合成，SS肽氨基酸序列和化學結構各個SS肽氨基酸序列如下:SS-02(Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2，Dmt=2'，6'-dimethyltyrosine)，SS-31(D-Arg-Dmt-Lys-Phe-N

4、H2)。
　　2.線粒體提取
　　取腎組織（皮質）100mg，按照試劑盒說明書提取線粒體。
　　3.SS肽體外進入線粒體的鑒定
　　三、動物模型建立和分組
　　1.單側輸尿管梗阻模型(UUO)建立:雄性SD大鼠（購自xx實驗動物中心），初始體重180-220 g，在恒溫清潔環(huán)境（南方醫(yī)科大學SPF級實驗動物中心）適應性飼養(yǎng)1周后，以3％戊巴比妥鈉0.15 ml/kg腹腔麻醉，仰臥位固定于手術臺上，剪毛后常規(guī)

5、碘酒酒精消毒，行腹中線切口（切口長度3-4 cm左右），逐層切開皮膚、肌肉及腹壁各層，鹽水紗布把腸包到旁邊，暴露左腎，向下探尋左側髂血管（左輸尿管跨過左髂總動脈），尋找到左輸尿管并游離，分別在輸尿管上1/3處和中1/3處用4-0號絲線結扎，在兩結扎點之間切斷輸尿管防止逆行性感染，逐層縫合關腹。假手術組僅將輸尿管游離但不結扎離斷。手術過程注意無菌操作原則。
　　2.動物分組
　　(1)假手術對照組:假手術組僅將輸尿管游離但不結

6、扎離斷;
　　(2)UUO大鼠+生理鹽水注射組:尾靜脈注射同UUO大鼠+RSA注射組及UUO大鼠+HOCl-RSA注射組等體積的生理鹽水:1次/日;
　　(3)UUO大鼠+RSA注射組:尾靜脈注射未經(jīng)修飾的正常大鼠白蛋白:RSA100 mg/kg，1次/日；
　　四、標本留取和指標檢測:
　　于分組后第14天麻醉處死動物，留取腎組織標本，進行后續(xù)檢測。
　　1.線粒體損傷指標檢測:
　　(1)電鏡觀察

7、腎皮質線粒體超微結構;
　　(2)差速離心法提取腎皮質線粒體，采用JC-1染色法結合熒光酶標儀檢測線粒體膜電位;
　　2.氧化應激指標檢測:
　　(1)腎皮質勻漿的HOCl-alb濃度檢測:以不同濃度氯胺T制備標準曲線，測定酸性條件下340 nm處吸光值;
　　(2)采用TBA顯色法檢測脂質過氧化產(chǎn)物硫代巴比妥酸反應活性物質(TBARS);
　　3.凋亡指標檢測:
　　(1)原位末端標記法(TUNEL

8、)法檢測腎小管上皮細胞凋亡及計數(shù);
　　(2)應用Western blotting檢測腎組織cleaved caspase-3/7/9、PARP-1(89kd)、線粒體及胞漿細胞色素C;
　　4.纖維化指標檢測:
　　(1)腎臟病理觀察:腎組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋、切片，行Masson染色，顯微鏡觀察腎間質纖維化病變程度并拍照;
　　(2)Western blot、real-time PCR及免疫組化檢測Col

9、lagen-Ⅰ、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Fibronectin。
　　結果：一、HOCl-alb對線粒體結構及功能的影響
　　1.注射HOCl-RSA對UUO大鼠腎皮質線粒體形態(tài)及結構的影響
　　電鏡結果顯示:與假手術相比，其他四組UUO大鼠腎皮質線粒體均出現(xiàn)不同程度的形態(tài)腫脹，灶性空化，嵴模糊不清甚至消失(P＜0.05)，HOCl-RSA注射進一步加重UUO大鼠腎皮質線粒體病變(P＜0.05)，SS-31治

10、療可減輕注射HOCl-RSA及UUO手術引起的腎皮質線粒體病變程度加重(P＜0.05)。
　　2.注射HOCl-RSA加重UUO大鼠腎皮質線粒體功能障礙
　　(1)注射HOCl-RSA降低UUO大鼠腎皮質膜電位
　　與假手術相比，其他四組UUO大鼠腎臟線粒體膜電位均顯著降低(P＜0.05)，注射HOCl-RSA進一步降低UUO大鼠腎皮質線粒體膜電位(P＜0.05)，SS-31可改善因注射HOCl-RSA及UUO手術引起

11、的腎臟線粒體膜電位下降(P＜0.05)。
　　(2)注射HOCl-RSA增加UUO大鼠腎皮質線粒體ROS產(chǎn)生
　　與假手術組相比，其他四組UUO大鼠腎小管線粒體產(chǎn)生的ROS均顯著升高(P＜0.05)，注射HOCl-RSA進一步增加了UUO大鼠腎小管線粒體ROS產(chǎn)生(P＜0.05)，SS-31可降低注射HOCl-RSA及UUO手術引起的腎皮質線粒體ROS水平增高（P＜0.05）。
　　二、HOCl-alb對大鼠體內氧化應

12、激的影響
　　1.與假手術組相比，其他四組UUO大鼠腎組織勻漿HOCl-alb水平均顯著增高(P＜0.05)，注射HOCl-RSA進一步增加了UUO大鼠腎組織勻漿HOCl-alb水平，SS-31治療可降低注射HOCl-RSA及UUO手術引起的腎組織勻漿HOCl-alb水平升高(P＜0.05)。
　　2.與假手術組相比，其他四組UUO大鼠腎組織勻漿TBARS水平均顯著增高(P＜0.05)，注射HOCl-RSA進一步增加了UUO

13、大鼠腎組織勻漿TBARS，SS-31治療可降低注射HOCl-RSA及UUO手術引起的腎組織勻漿TBARS水平的升高（P＜0.05）。
　　三、HOCl-alb對腎小管上皮細胞調亡的影響
　　1.與假手術相比，其他四組UUO大鼠腎小管上皮細胞凋亡明顯增多(P＜0.05)，且注射HOCl-RSA可進一步增加UUO大鼠腎小管上皮細胞凋亡數(shù)目(P＜0.05)，而SS-31治療可抑制因注射HOCl-RSA及UUO手術引起的大鼠腎小管上

14、皮細胞的凋亡增多(P＜0.05)。
　　2.Western結果顯示:與假手術相比，其他四組UUO大鼠腎皮質線粒體內CytoC蛋白水平均顯著降低(P＜0.05)，胞漿CytoC蛋白水平均顯著增高(P＜0.05);注射HOCl-RSA可加劇UUO大鼠腎皮質CytoC由線粒體向胞漿轉移(P＜0.05)，SS-31治療可阻止因注射HOCl-RSA及UUO手術引起的腎皮質CytoC由線粒體向胞漿轉移(P＜0.05)。
　　四、HOCl

15、-alb對腎間質纖維化的影響
　　1.MASSON結果顯示:假手術組未見明顯異常，其他四組UUO大鼠腎臟均出現(xiàn)不同程度膠原沉積，HOCl-RSA注射進一步加重UUO大鼠腎間質纖維化程度，SS-31治療可減輕因注射HOCl-RSA及UUO手術引起的腎間質膠原沉積增多。
　　2.Western blot與Real-time PCR結果均顯示:與假手術相比，其他四組UUO大鼠腎臟Collagen-Ⅰ、Fibronectin、α-S

16、MA水平均顯著增高(P＜0.05)，注射HOCl-RSA進一步增加UUO大鼠Collagen-Ⅰ、Fibronectin、α-SMA表達(P＜0.05)，SS-31治療可改善注射HOCl-RSA及UUO手術引起纖維化加劇(P＜0.05)。
　　結論：一、UUO大鼠腎組織氧化應激標志物明顯增加、線粒體結構和功能受損、腎間質細胞凋亡和腎間質纖維化;
　　二、HOCl-alb是已知的促氧化應激介質，反復注射加重UUO大鼠的上述病理