蛋白激酶B抑制劑派立福辛聯(lián)合神經(jīng)酰胺C6抗人腦膠質瘤的機制研究.pdf

1、目的：
　　觀察蛋白激酶B抑制劑哌立福辛(perifosine)、神經(jīng)酰胺C6(ceramide)對腦膠質瘤細胞增殖、凋亡、自噬等生物學行為的影響，探討哌立福辛與神經(jīng)酰胺C6聯(lián)合用藥的協(xié)同機制，為腦膠質瘤的靶向治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.對膠質瘤細胞予以不同濃度及時間的哌立福辛處理，運用MTT法及細胞集落實驗檢測腫瘤細胞增殖活性；組蛋白 DNA ELISA法及Annexin V/PI雙染法檢測腫瘤細胞凋亡改

2、變；Western-Blot法檢測AKT1、p-AKT、p-S6、p-AMPKα、p-ACC以及ATG-5、LC-3B、Beclin-1的表達情況；高效液相色譜法檢測膠質瘤細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的水平的變化。
　　2.對膠質瘤細胞予以不同濃度及時間的神經(jīng)酰胺 C6處理，MTT法檢測其對細胞活力的影響；神經(jīng)酰胺C6、哌立福辛以及二者聯(lián)合處理膠質瘤細胞，運用MTT法、Trypan blue實驗檢測腫瘤細胞活性改變；Western-Blot法檢

3、測ERK、p-AKT、p-S6、p-S6K、p-ERK以及ATG-5、LC-3B、Beclin-1的表達情況。
　　3.運用自噬抑制劑3-MA、氯喹（Cq）和caspase抑制劑z-VAD-fmk對上述各組細胞予以干預，檢測腫瘤的細胞活力變化；對膠質瘤細胞予以3-MA聯(lián)合哌立福辛處理，MTT法檢測腫瘤細胞活性，組蛋白 DNA ELISA法及Annexin V/PI雙染法檢測腫瘤細胞凋亡改變；同樣方法檢測神經(jīng)酰胺C6聯(lián)合哌立福辛對膠

4、質瘤細胞凋亡的影響。
　　4.構建ATG5-siRNA轉染HEK293細胞株建立自噬缺陷細胞；MTT法檢測哌立福辛及神經(jīng)酰胺C6對自噬缺陷細胞活性影響，Annexin V/PI雙染法檢測其凋亡改變。
　　結果：
　　1. MTT法和細胞集落實驗結果顯示哌立福辛顯著抑制膠質瘤細胞增殖，其抑制效應呈時間和濃度依賴性；Annexin V/PI雙染法及組蛋白DNA ELISA法提示哌立福辛能夠誘導膠質瘤細胞凋亡，但誘導作用不明

5、顯；Western-Blot法檢測到哌立福辛下調p-AKT的表達，上調自噬相關蛋白ATG-5、LC-3B、Beclin-1蛋白表達；高效液相色譜法結果顯示哌立福辛能夠輕度提高細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的水平。
　　2. MTT法以及Trypan blue實驗結果顯示神經(jīng)酰胺C6聯(lián)合哌立福辛對膠質瘤細胞增殖抑制具有協(xié)同效應；組蛋白DNA ELISA法及Annexin V/PI雙染法結果表明膠質瘤細胞凋亡誘導顯著增加；Western-Blot法結

6、果表明聯(lián)合用藥抑制自噬相關蛋白ATG-5、LC-3B、Beclin-1蛋白表達，對p-AKT影響不明顯。
　　3.自噬抑制劑3-MA，Cq顯著抑制膠質瘤細胞活性，但抑制作用可被z-VAD-fmk阻斷，3-MA可增強哌立福辛對膠質瘤的細胞增殖抑制效應；組蛋白 DNA ELISA法及 Annexin V/PI雙染法顯示神經(jīng)酰胺C6可顯著增強哌立福辛對膠質瘤細胞的凋亡誘導，z-VAD-fmk可阻斷聯(lián)合用藥的協(xié)同作用。
　　4.成功

7、構建自噬缺陷細胞；哌立福辛對自噬缺陷細胞的增殖抑制作用顯著增強，聯(lián)合神經(jīng)酰胺C6未見明顯的協(xié)同效應；Annexin V/PI雙染法檢測結果顯示哌立福辛對自噬缺陷細胞凋亡誘導作用明顯增強。
　　結論：
　　1.哌立福辛有望作為膠質瘤分子靶向治療治療藥物候選之一，具有潛在的臨床應用價值。
　　2.神經(jīng)酰胺C6增強哌立福辛對膠質瘤細胞的殺傷作用，具有協(xié)同效應。
　　3.協(xié)同作用的機制是派立福辛抑制膠質瘤細胞增殖的同時誘